[发明专利]一种人工毛乳头样细胞的获取方法

权利要求书

1.一种人工毛乳头样细胞的获取方法，包括以下步骤：

1）提取并体外培养人真皮成纤维细胞，选取10代内的人真皮成纤维细胞；按质量体积比配置成1%海藻酸钠和10%D-甘露醇混合溶液，充分混合后在室温下过夜溶解，充分溶解后在生物安全柜中使用0.22 μm孔径的除菌过滤器和无菌注射器进行过滤除菌，从而得到无菌的海藻酸钠水凝胶；

2）提取人真皮成纤维细胞并体外大量培养；

3）将人真皮成纤维细胞悬浮于1）配置好的海藻酸钠水凝胶中，形成细胞悬浮液，使每毫升细胞悬浮液中含有6×10⁶个人真皮成纤维细胞；

4）将步骤(3)中的细胞悬浮液转移至5 ml无菌注射器中，并将注射器针头替换为23 G针头；

5）利用高压电场微囊发生器使 4）中的细胞悬液形成直径为350-550 µm的微滴状态，然后滴入浓度为2% CaCl₂溶液中使得成纤维细胞处于较为稳定的水凝胶微球中，获得实心微球沉淀物；得到微球的静电喷雾参数：静电推进泵的流速为3 ml/h，静电发生装置电压为5-6 kV，静电喷雾时间不得长于20 min；

6）使用无菌生理盐水将步骤(5)所得到的微球洗涤两遍，以除去喷雾过程中接收装置内大量的CaCl₂，随后加入含0.5 mg/ml PLL 的DMEM培养液 37 ℃ 10 min，使PLL在微球表面形成一层薄膜，有助于固定微球的形态；

7）去除PLL溶液，加入0.1%海藻酸钠-1%甘露醇溶液反应4 min，以除去微球周围多余的PLL，并在微球外部形成一层较为疏松的海藻酸钠保护层；反应结束后加入5.5 mM柠檬酸钠溶液，3 min，以除去残留的Ca²⁺ 并稍微溶解海藻酸钠与Ca²⁺ 所形成的薄膜；反应结束后，用DMEM洗涤微球，随后加入培养液进行培养，培养过程中使用含20%胎牛血清，1%青链霉素和1×谷氨酰胺混合液的DMEM高糖培养基对微球包埋的细胞进行培养，并每隔两天更换培养基，培养时间为9d。