[发明专利]一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于 ，包括以下步骤：

A、获取人羊膜上皮细胞hAECs组织；

B、以低糖DMEM完全培养基为应用基质，恒温体外培养人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次；

C、当细胞生长融合度达到规定数值，用胰蛋白酶溶液消化，终止消化后，离心后用D-PBS洗涤，再离心，收集细胞；

D、将步骤C中收集的细胞接种含低糖DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达规定值时，进行传代培养，收集适当代数hAECs细胞；

E、利用无血清低糖DMEM培养基调配透明质酸溶液；

F、取步骤D中的hAECs细胞加入到步骤E配制的透明质酸溶液中，调整hAECs细胞在溶液中的个数达到规定数值，混匀；

G、通过静脉注射的方式将步骤F中得到的细胞组合制剂输入到I型糖尿病患者的体内。

2.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B中的羊膜上皮细胞的培养及诱导的各项具体技术参数如下：以LG-DMEM完全培养基为应用基质，在37°C，含5% CO₂及85-100%空气饱和湿度条件下，恒温体外培养所分离的人羊膜上皮细胞，每隔2天换液一次。

3.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤C中的诱导分化技术如下：当细胞生长融合度达80%以上，用0.02% EDTA-2Na0.25%胰蛋白酶溶液消化5-8分钟，终止消化后，离心，D-PBS洗涤，再离心收集细胞。

4.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：步骤D中的接种培养，是以1×10⁵ -1×10⁷个/mL的密度接种到含LG-DMEM完全培养基的培养瓶中，当细胞生长融合度达80%以上时，进行传代培养，选取第2-4代的hAECs细胞，用于移植治疗。

5.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：步骤E中的透明质酸选用分子量为20-2200KD。

6.根据权利要求4所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：根据所需配制的溶液体积，称取透明质酸，用无血清LG-DMEM培养基溶解，配制要求透明质酸溶液浓度为0.01-2mg/mL，用于移植治疗。

7.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂中hAECs细胞浓度为1×10⁵-1×10¹⁰个/mL。

8.根据权利要求1所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述hAECs和透明质酸调配的细胞组合制剂的静脉注射量为0.01-10mL。

9.根据权利要求1-7任一权利要求所述的一种用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的制备方法，其特征在于：所述hAECs联合透明质酸用于治疗I型糖尿病，还包括在其中加入药学上可接受的载体。

10.根据权利要求1-9制备的任一用于治疗I型糖尿病的细胞组合制剂的应用，其特征在于：每2周进行静脉注射等量的hAECs细胞组合制剂，连续移植2次以上。