[发明专利]一种测定抗VEGF抗体活性的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种测定抗VEGF抗体活性的方法，用转染了VEGF受体、IL‑1R3、IL‑1R6以及报告基因的效应细胞作为检测材料，由anti‑CD3和anti‑CD28抗体激活Jurkat细胞，并加入VEGF配体，VEGF配体通过与效应细胞上的VEGFR的结合，使得细胞内的IL‑1R3和IL‑1R6相互作用，激活下游的NFAT信号通路，使得报告基因得以表达。当加入抗VEGF抗体后，抗VEGF抗体能够竞争性的与VEGF配体结合，阻断VEGF配体与其受体VEGFR的结合，造成下游的报告基因表达量的减少。该方法操作步骤更为简便，大大缩短了实验时间，检测灵敏度高和准确性好。

技术领域

本发明属于药物活性检测方法技术领域，具体涉及一种测定抗VEGF抗体活性的方法的建立及其应用。

背景技术

肿瘤是一种血管生成依赖性疾病，肿瘤的生长离不开血管及血液的供应。肿瘤血管靶向治疗(tumor vascular targeting therapy)逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。肿瘤组织产生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，与血管内皮细胞上的受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)结合后，能够通过胞内信号转导系统促进血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成以及微血管通透性，并诱导血管生成，维持肿瘤的继续生长。VEGF是目前发现的功能最重要的血管生长因子，与诸多生理及病理过程有关。已有研究表明，多种实体瘤中存在VEGF的过表达，这使得VEGF成为肿瘤治疗的靶点。

目前VEGF主要有5大类，分别为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、以及PlGF。而VEGF的受体(VEGFR)分为三类，分别为位于造血干细胞的VEGFR1、位于血管内皮细胞的VEGFR2和位于淋巴内皮细胞的VEGFR3。VEGF-VEGFR信号通路的相关抗体或融合蛋白通过与VEGF的结合，进而阻止VEGF与其受体进行结合，进而阻止其功能的发挥。抗VEGF抗体主要有贝伐珠单抗(Bevacizumab，Avastin)、VEGF Trap(Aflibercept，Eylea)、雷莫芦单抗(Ramucirumab，Cyramza)及雷珠单抗(ranibizumab,Lucentis)等等。

其中，贝伐珠单抗是由美国基因泰克公司(Genentech)研发的一种重组人源化IgG1单克隆抗体，能够高亲和力地选择性结合VEGF，通过空间位阻阻断VEGF与其血管内皮细胞表面上的受体Flt-1(VEGFR-1)和KDR(VEGFR-2)结合，从而中和了VEGF的生物学活性，特异性抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的生长和转移。作为世界首个抗VEGF的抗体药物，贝伐珠单抗已经被国际权威的NCCN推荐为多种转移性肿瘤的一线治疗药物，在全球转移性癌症患者中得到广泛应用。EYLEA(aflibercept)是一种由人VEGFR-1和2细胞外结构区部分融合至人IgG1的Fc部分组成的重组融合蛋白，其作用如同可溶性诱饵受体[decoyreceptor]与VEGF-A和PlGF结合，抑制其VEGF受体结合和激活。雷莫芦单抗是抗VEGFR2的人源单克隆抗体。雷珠单抗是靶向VEGF的Fab抗体片段。

生物学活性是上述治疗类抗体质量性能参数中一个关键指标，为了对此治疗性抗体进行有效的质量控制，首先要建立切实可行的测定其生物学活性的方法。传统的检测抗VEGF抗体的方法是利用VEGF能够刺激HUVEC细胞增殖，而抗VEGF单抗可通过结合VEGF来抑制HUVEC细胞增殖的原理进行检测。但由于HUVEC为原代贴壁细胞，生长周期慢，整个实验过程需要72小时，检测时间长、灵敏度低。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速且灵敏度高的测定抗VEGF抗体活性的方法。

一种测定抗VEGF抗体活性的方法，包括如下步骤：

提供转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞；