[发明专利]一种疾病相关的菌群定量扩增方法

说明书

本发明公开了一种疾病相关的菌群定量扩增方法，包括三个部分，即扩增菌种的选定、菌种的引物设计和PCR(Polymerase Chain Reaction)反应程序的设计。首先，根据疾病与菌种的潜在关系，确定需要检测的菌种类型；其次，根据所确定的菌种，通过文献或者各种专业数据库查找相关菌种16SrDNA所对应的基因序列，再锁定序列中菌种特异的可变区片段，并根据该片段设计特异性的PCR引物，并检查引物特异性；最后，将提取的菌种DNA放入PCR反应管并加入四种dNTP、Mg²⁺、Taq聚合酶、水等反应物，并在合适的温度条件下进行扩增反应，待反应结束后根据荧光扩增吸收曲线计算各菌种的含量。本方法具有操作简单、检测快速、费用低廉、定量准确的优点，适合相关疾病的广泛筛查与预防工作，具有较好的推广性。

技术领域

本发明涉及疾病相关的菌群定量扩增方法。

背景技术

人们很早就认识到，细菌与人类生活息息相关，如早在几千年前，华夏先祖就发明了酿酒技术，其中的主要成分酒精即是细菌发酵的产物；近代以来，随着技术的进步和认识的深入，人们发现细菌与人类健康也密切关联，如科学家发现，双歧杆菌属(Bifidobacterium)对人类具有显著的益生作用，而其他菌属，如普氏菌属(Prevotella)等，可能引起人体炎症反应等。近十年间，肠道菌群相关研究大规模兴起，大大拓展了人类认识肠道菌群的深度和广度，使人们意识到肠道菌群与人类健康的紧密联系。研究发现，正常状态下，健康人的肠道菌群组成结构在一定范围内保持相对恒定；但在人体健康状况发生变化的时候，人体肠道菌群的组成结构会呈现较大变化，且肠道菌群结构的变化与疾病呈现显著相关性。通过对肠道菌群组成结构的检测，人们可以根据检测结果与正常状态的组成结构的对比来判断肠道的健康状态，同时推测人们可能面临的疾病风险，并通过采取相应的措施，来有效提前预防某些疾病，促进人体健康。在此过程中，准确检测肠道菌群组成成为其中的关键。

以往肠道菌群的检测手段大致有两种，即细菌涂片培养法、高通量测序法和定量扩增技术。细菌涂片培养法是最早采用的方法，它的特点是检测方式简单、对实验设备要求较低，但是其具有很大的缺陷，很多常见菌群不能培养，因而无法检测。此外，该检测方法易受到外源菌污染，实验条件严格，实验周期长，对操作要求较高；高通量测序法是最近二十年间兴起的测序技术，它的特点是操作简单方便，对检测菌种无限制。其缺点在于实验费用昂贵，实验结果可靠性差，限制了其大规模推广使用。上述的检测手段暴露出的缺陷严重限制了通过菌群检测技术来筛查预防相关疾病的广泛应用，急需一种可靠的方法来推广应用此项技术。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的不足之处开展的实验研究，旨在提供一种疾病相关的菌群定量扩增方法，推进菌群检测筛查相关疾病技术的应用，促进公众健康。

本发明所称的疾病相关的菌群定量扩增技术，其实质是通过设计特异性的菌种引物进行PCR反应来定量疾病相关的菌群含量。所要解决的技术问题是针对选定的菌种设计高特异性的引物，并探索合适的PCR反应条件，以期得到高特异性的扩增产物，便于菌种的精确定量，来筛查相关疾病。

根据现有资料，我们能够确定相关疾病与某些菌种有强的关联性；同时，菌群检测作为一个整体评估方法，需要考虑待测菌种在人体含量高低，及选取对人体不同作用方式(益生菌、中性菌、致病菌)的代表菌种。通过菌种类型确定疾病类型理论上是可行的，但是这样就大大扩展了菌种检测范围和疾病筛查范围，以现有研究水平，对于很多疾病来说，其与菌群的关系尚不明确，而且此方式的操作成本也大为增加，不具有可行性。

本发明所用的技术方案是：一种疾病相关的菌群定量扩增方法，包括以下步骤：

步骤1，根据疾病与菌种的潜在关系，确定需要检测的菌种类型；

步骤2，根据所确定的菌种，通过文献或者各种专业数据库查找相关菌种16S rDNA所对应的基因序列；