[发明专利]一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法

说明书

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法。本发明将植物甾醇代谢途径中甾醇C27位单加氧酶Cyp125引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法。Cyp125的过表达促进分枝杆菌甾醇C27单加氧酶比酶活提高了22.2％，提高了胞内NAD⁺的再生，使胞内NAD⁺/NADH比例提高131％，同时意外的发现该酶的过表达使菌体生物量提高18.7％，最终达到使转化周期缩短24h，AD(D)产量提高10.0％的效果。

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法。

背景技术：

雄烯二酮，雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，是生产可的松、盐皮质激素类药物、常规口服避孕药和蛋白同化激素等其他甾体激素类药物的重要中间体，可以通过微生物降解植物甾醇侧链获得。植物甾醇代谢生成AD(D)的代谢途径复杂，不仅受自身代谢途径的影响也受胞内辅酶的调控。目前基于植物甾醇代谢途径分析提高AD(D)生产的策略主要包括：1、植物甾醇代谢途径中关键酶的改造；2、对植物甾醇代谢途径依赖的辅酶再生系统进行调控。

关于植物甾醇代谢途径中酶的改造，主要集中于通过过表达或敲除植物甾醇氧化途径中的酶来提高AD(D)生产效率及产量。例如过表达胆固醇氧化酶及3β-羟基甾体脱氢酶等，或失活3-酮甾体-9α-羟化酶以及3-酮甾体-1-脱氢酶。研究结果显示敲除某基因以后，会在不同程度上降低植物甾醇的转化率和产率，即造成菌体整体生产强度的下降。因此还需要从菌体整体代谢调控方面深入探索、系统研究，以寻求提高雄烯二酮生产效率的方法。植物甾醇代谢途径中许多关键酶属于辅酶依赖型酶，辅因子依赖的代谢途径不仅受代谢途径中酶的控制，而且还受辅因子浓度及辅因子氧化还原态比例的控制。前期研究通过调控微生物中辅酶再生系统来促进AD(D)生产效率，通过过表达NADH氧化酶促进胞内NAD⁺的再生，结果表明AD(D)的生成量有所提高，但是菌体生长受到了明显的抑制，使AD(D)的生产周期延长(Su LQ,Shen YB,Zhang WK,Gao T,Shang ZH,Wang M(2017)Cofactor engineeringto regulate NAD⁺/NADH ratio with its application to phytosterolsbiotransformation.Microb Cell Fact 16(1):182-192)。

微生物甾醇或胆固醇侧链降解开始于C27位羟基化进而氧化为C27位羧酸，甾醇C27单加氧酶(Cyp125)属于细胞色素P450酶，依赖NADH为辅酶催化甾醇侧链末端C进行连续的氧化反应，起始甾醇侧链降解途径。

发明内容：

为了解决上述问题，探索一种提高分枝杆菌AD(D)生产效率的方法，对植物甾醇代谢途径及调控途径综合考虑是有必要的。植物甾醇代谢途径中甾醇C27位单加氧酶Cyp125是依赖还原型辅酶NADH的酶，属于植物甾醇侧链降解途径初始酶，本发明将其引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法。

本发明实现上述目的的技术方案如下：一种产雄烯二酮的基因工程菌，是以新金分枝杆菌为宿主细胞，过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的；

所述cyp125-3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述宿主细胞为新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3，该菌株可从中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC)购买获得，编号CICC 21097；

优选地，表达载体为质粒pMV306；