[发明专利]一种检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种用于检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包括：1)DNA提取试剂，2)包含TRECs基因、KRECs基因和TRAC基因插入序列的标准品，3)包含TRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液I，4)包含KRECs基因、TRAC基因的荧光PCR引物和检测探针的荧光PCR反应液II。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，检测方法简单快捷，实验结果可靠，不仅可以筛查SCID和抗体缺乏为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞和B细胞发育相关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期诊断及治疗。

技术领域

本发明属于体外核酸诊断领域，涉及一种检测T细胞受体切除环(T-cellreceptor excision circles，TRECs)和K-删除重组切除环(K-deleting recombinationexcision circles，KRECs)基因的实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒及其应用。

背景技术

重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease,SCID)是联合免疫缺陷病中最严重的类型，患者常常在出生后1年内死亡。根据国外大范围筛查得出SCID的发生率约为1/58000活产新生儿，显著高于以往认为的1/100000。SCID是由多种遗传因素引起的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞数量缺乏和(或)功能障碍，导致体液免疫、细胞免疫同时存在严重缺陷，这种原发性免疫缺陷常被定义为初始T细胞缺乏。不经治疗，SCID的病死率为100％。目前常用的治疗方法为造血干细胞移植(hematopoietic stem celltransplantation,HSCT)、基因治疗(gene therapy,GT)或酶替代治疗(enzymereplacement therapy,ERT)进行免疫重建。Pai等通过随访240例移植后的SCID患者，认为<3.5月龄的 SCID患者移植的存活率显著高于>3.5月龄或继发感染的患儿，且移植后的存活率主要与患儿有无感染相关，与移植物的来源无明显关联。因此，对SCID患者进行早期诊断及早期治疗，可显著改善患儿的预后。

SCID患儿多数存在T细胞缺乏，因此淋巴细胞绝对计数可作为SCID的筛查手段之一。 Chan和Puck在2005年首先报道了采用定量PCR方法检测T细胞受体切除环(T－cellreceptor excision circles,TRECs)。TRECs是TCR形成过程中产生的无功能的DNA片段，约70％的αβTCR在生成过程中可同时生成TRECs，这些DNA片段不随T细胞的分裂而复制，稳定存在于细胞内，因此TRECs定量可以间接反映胸腺输出的初始T淋巴细胞数量。若 TRECs减少或缺失，则高度怀疑SCID，进一步进行流式细胞及基因诊断确诊。通过TRECs 筛查SCID可以与其他新生儿常规筛查项目共用干血纸片，有利于该筛查方法的正式大范围推广。除了SCID外，TRECs检测还能发现包括21三体、DiGeorge综合征、特发性T淋巴细胞减少症等其他引起T淋巴细胞计数严重减少的疾病。

TRECs检测价格便宜，包括设备、劳务和试剂等所需要的费用约为4.25美元/婴儿，与其他筛查项目价格相当或更低；方法高度敏感、特异，筛选试验的灵敏度接近100％，可有效检出SCID患儿；因此采用TRECs进行SCID新生儿筛查可有效应用到公共卫生事业，被认为是美国国家标准的新生儿筛查项目。

一些非特异、表现延迟的SCID患者出生时仅通过TRECs检测可能遗漏，需要K－删除重组切除环等其他检测手段协诊。KRECs是B细胞成熟过程中，编码B细胞受体基因重排时产生的非复制的小片段DNA产物，可以作为伴有B细胞数量减少的B淋巴细胞免疫缺陷的筛查方法。例如延迟性ADA患者中，T细胞分裂可能对有毒代谢产物增加的耐受性较好，而B细胞则更容易裂解，KRECs有利于此类患者的早期发现；KRECs在X－连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的筛查中也发挥着重要作用。理想情况下，应该联合TRECs－KRECs 进行新生儿免疫缺陷的筛查。