[发明专利]一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的构建及其应用

权利要求书

1.一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，该嵌合型抗原受体由CD8抗原的前导肽、抗间皮素单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号域和抗PD-L1抗体分泌区依次连接组成；所述抗间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗PD-L1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述铰链区为人CD8α、或者TCRβ中的任一种，所述CD8α铰链区DNA序列如SEQ IDNO.3所示。

3.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD4、CD8或CD28跨膜区中的任一种；所述CD28跨膜区DNA序列如SEQID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD3δ、4-1BB、CD137、CD134、CD28或CD86中的至少一种；所述CD3ζ胞内信号域DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1所述的一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，其特征在于，所述抗PD-L1抗体分泌区编码序列包括内部核糖体进入位点序列、抗PD-L1抗体序列和人IgG1序列。

6.权利要求1-5中任一项所述靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体的应用，其特征在于，所述嵌合型抗原受体应用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤细胞过表达间皮素或表达PD-L1。

7.一种靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞能特异性的抑制、杀伤表达间皮素的肿瘤细胞，并阻断PD-L1/PD-1信号对T细胞活性的抑制效应。

8.权利要求7所述的靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体，具体方法为：

a、获取CD8抗原的前导肽、抗间皮素SS1P单链抗体基因片段、铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段和抗PD-L1抗体分泌区基因片段；

b、基因融合CD8抗原的前导肽与抗间皮素SS1P单链抗体基因片段，从而形成引导链-间皮素SS1P scFv；

c、基因融合铰链区的基因片段、跨膜区基因片段、胞内信号区基因片段和抗PD-L1抗体分泌区基因片段，从而形成铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1 scFv-Fc IgG1；

d、基因融合所述引导链-间皮素SS1P scFv和所述铰链区-跨膜区-胞内信号区-antiPD-L1 scFv-Fc IgG1，从而形成引导链-间皮素scFv-铰链区-跨膜区-胞内信号区-antiPD-L1 scFv-Fc IgG1；

(2)构建靶向间皮素并携带PD-Ll阻断剂的嵌合型抗原受体的表达载体：

将引导链-间皮素scFv-铰链区-跨膜区-胞内信号区-anti PD-L1 scFv-Fc IgG1接入载体，而获得嵌合型抗原受体(CAR)表达载体；

(3)将嵌合型抗原受体表达载体加入到保护液稀释的T细胞中进行电转，培养扩增后，通过筛选，获得可以特异性结合间皮素和分泌PD-L1的CAR-T细胞。

9.权利要求7所述的CAR-T细胞的应用，所述CAR-T细胞应用于制备抗肿瘤的药物，所述肿瘤细胞过表达间皮素或表达PD-L1。