[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法

说明书

本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，包括：谷氨酸棒杆菌细胞收集及淬灭；胞内代谢物提取；代谢物衍生化；最后通过GC‑MS及多元统计对样品分析得到代谢组结果；所述谷氨酸棒杆菌代谢组的分析手段涉及代谢反应的终止、代谢物的提取、代谢物的鉴定与定量、统计学分析，从而获得谷氨酸棒杆菌发酵过程中不同阶段代谢物的定性和定量结果，为谷氨酸棒杆菌代谢组的分析提供了方法，这种方法对促进谷氨酸棒杆菌的代谢组学及代谢工程研究具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌是一种好氧的、无芽孢的、细胞为短小棒状两端钝圆呈八字排列的革兰氏阳性细菌，不运动，菌落湿润、圆形。谷氨酸棒状杆菌作为食品级的微生物，具有易培养、不产孢子等优点，因此是一类重要的工业生产菌株，可用于生产各类氨基酸、抗生素等。目前传统的诱变方法仍然是谷氨酸棒杆菌工业生产菌株的主要获得途径，但由于其遗传背景不明，难以通过进一步诱变提高氨基酸产量。

可见，随着各种基因操作技术的不断成熟，谷氨酸棒杆菌在工业发酵和生物技术中扮演越来越重要的作用，被广泛用于生产氨基酸、抗生素等，但是这些谷氨酸棒杆菌前期的选择与优化是一项巨大的工作。如何调节细胞生长与目标产物的合成使之达到平衡是目前工程菌改造的一大难点，也是代谢组学技术应用比较成功的领域之一。由于谷氨酸棒杆菌易于培养、遗传背景清楚，和能源、环境、食品等领域都息息相关，且对代谢通路和基因的微调控等特征掌握的较为全面，因此代谢组学在该领域的研究意义重大。但是谷氨酸棒杆菌相关的代谢组学研究报道较少，因此对谷氨酸棒杆菌发酵过程中相关代谢物变化规律的研究极为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，具体步骤如下：

(1)胞内代谢物处理

①细胞收集及淬灭

取谷氨酸棒杆菌发酵液，并4℃离心以除去培养基中大部分固体杂质，将细胞沉淀置于液氮中淬灭反应，液氮中保存待用；

②代谢物提取

将收集好的细胞置于液氮中研磨成粉末并放入离心管中，加入预冷的代谢物提取液、所述代谢物提取液为体积比为1:1的甲醇与水的混合溶液，震荡均匀后，置于液氮中1min后，取出后于室温融化，使细胞内代谢物逐渐被提取液溶出；离心取上清至离心管中加入氘标记的琥珀酸作为内标，混匀后预冻、再真空冷冻干燥；

③衍生化处理及GC-MS测定

向真空冷冻后的细胞粉末中加入甲氧基氨盐酸盐的吡啶溶液水浴进行肟化反应；反应结束后再加入MSTFA水浴进行硅烷化反应；然后对溶液进行GC-MS测定；

(2)GC-MS测定条件

色谱柱：DB-5毛细管色谱柱，J&W Science,USA

进样口温度：250℃

载气：高纯氦气(纯度＞99.999％)；流速1mL/min

接口温度：280℃

柱温箱温度梯度：70℃(2min)→5℃/min升至290℃→290℃(3min)

离子源温度：230℃

(3)代谢物鉴定与定量分析