[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法

权利要求书

1.一种谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)胞内代谢物处理

①细胞收集及淬灭

取谷氨酸棒杆菌发酵液,4℃离心以除去培养基中大部分固体杂质，将细胞沉淀置于液氮中淬灭反应，液氮中保存待用；

②代谢物提取

将收集好的细胞置于液氮中研磨成粉末并放入离心管中，加入预冷的代谢物提取液,所述代谢物提取液为体积比为1:1的甲醇与水的混合溶液，震荡均匀后，置于液氮中1min后，取出后于室温融化，使细胞内代谢物逐渐被提取液溶出；离心取上清至离心管中加入氘标记的琥珀酸作为内标，混匀后预冻,再真空冷冻干燥；

③衍生化处理及GC-MS测定

向真空冷冻后的细胞粉末中加入甲氧基氨盐酸盐的吡啶溶液并水浴进行肟化反应；反应结束后再加入MSTFA并水浴进行硅烷化反应；然后对溶液进行GC-MS测定；

(2)GC-MS测定条件

色谱柱：DB-5毛细管色谱柱，J&W Science,USA

进样口温度：250℃

载气：高纯氦气(纯度＞99.999％)；流速1mL/min

接口温度：280℃

柱温箱温度梯度：70℃(2min)→5℃/min升至290℃→290℃(3min)

离子源温度：230℃

(3)代谢物鉴定与定量分析

根据色谱图中保留时间及质谱图中特征离子确定化合物结构；然后将样品中各种代谢物峰面积进行积分；将各个代谢物峰面积与同个样品中的内标物峰面积利相比，得到各个代谢物的相对丰度；用SIMCA-P软件对所有预处理后的数据进行多元统计分析，整体分析各个样品间的代谢差异。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，其特征在于：所述步骤(1)①细胞收集及淬灭的具体方法为：在谷氨酸棒杆菌发酵的前期、中期、后期共取4-6个取样点，各取50-100ml发酵液，4℃离心3min，以除去培养基中大部分固体杂质；然后6000-8000rmp，4℃离心10-15min；弃上清，细胞沉淀用PBS缓冲液清洗两次，然后用去离子超纯水清洗一遍，离心后，将细胞沉淀置于液氮中淬灭反应，液氮中保存待用。

3.根据权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，其特征在于：每1mol/L所述PBS缓冲液中含有NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.42g、KH₂PO₄ 0.27g。

4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，其特征在于：所述步骤(1)②代谢物提取的具体方法为：将收集好的细胞置于液氮中研磨成粉末，用天平称取50-100mg细胞粉末于1.5mL离心管中，每个时间点取4份，加入1mL预冷的代谢物提取液，震荡均匀后，置于液氮中1min后，取出后于室温融化，如此反复冻融3次，使细胞内代谢物逐渐被提取液溶出；10000-12000rmp离心10-15min，取上清100-200μL转移至新的1.5mL离心管，加入10-20μL内标、所述内标为0.1mg/mL氘标记的琥珀酸，混合均匀后在-80℃冰箱预冻24h,然后再真空冷冻干燥24h。

5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌代谢组的分析方法，其特征在于：所述步骤(1)③衍生化处理的具体方法为：向真空冷冻后的细胞粉末中加入20mg/mL甲氧基氨盐酸盐的吡啶溶液50μL于40℃水浴中反应90min，进行肟化反应；反应结束后再加入80μLMSTFA于40℃水浴，反应30min，进行硅烷化反应；然后将溶液转移到样品瓶中，进行GC-MS测定。