[发明专利]一种DNA甲基化检测试剂盒及方法在审

专利信息
申请号: 201810843846.X 申请日: 2018-07-27
公开(公告)号: CN109385464A 公开(公告)日: 2019-02-26
发明(设计)人: 禹汇川;骆衍新;白亮亮;唐冠楠;王小琳;李英杰;黄增鸿;黄美近;汪建平 申请(专利权)人: 中山大学附属第六医院
主分类号: C12Q1/6858 分类号: C12Q1/6858;C12M1/34
代理公司: 北京市万慧达律师事务所 11111 代理人: 谢敏楠;张孟迪
地址: 510000 广东*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 试剂盒 甲基化 小沟结合剂 侧翼序列 方法使用 检测试剂 基因体 灵敏 孤立
【说明书】:

发明涉及一种DNA甲基化检测试剂盒和方法,尤其涉及一种针对侧翼序列没有CpG位点的检测试剂盒和方法,该试剂盒和方法使用了与小沟结合剂(minor groove binder,MGB)结合的Taqman探针,不仅可以测定CpG岛(CpG Island,CGI)的甲基化,也可测定基因体中的CpG open sea等这种两侧序列没有CpG的孤立CpG位点。该技术不仅非常特异且灵敏,而且操作简便,不需要对照反应和完全甲基化的DNA标准品作为参照,从而可以克服它们带来的缺陷。此外,它具有比现有的MethyLight技术更高的重复性和准确性。

技术领域

本发明属于分析方法技术领域,涉及一种DNA甲基化检测试剂盒及方法,尤其是针对侧翼序列没有CpG位点的DNA甲基化检测试剂盒及方法。

背景技术

癌症组织中存在的胞嘧啶-5DNA甲基化(m5C)被认为是具有潜在临床价值的DNA表观修饰[1]。在脊椎动物中,m5C主要出现在CpG二核苷酸。在多种肿瘤中已经证实,抑癌基因启动子的CpG岛(CGI)异常甲基化导致了转录失活[2]。然而,启动子内的CGI仅代表甲基化的一小部分,而主要位于基因体中的CpG open sea则代表了真核生物中最保守的DNA甲基化靶标,但该区域甲基化的功能尚不清楚。最近的研究揭示了非启动子区域(如基因体和UTR)甲基化对基因表达的协同效应,基因体甲基化可能是癌症中潜在的治疗靶点[3]。此外,基因体甲基化可能是RNA选择性剪接调控的潜在机制[4],并且可限制转录起始,从而阻止异常转录[5]。我们在以往研究中通过EPIC甲基化芯片发现,复发和非复发结直肠癌患者的差异甲基化位点(differential methylation positions, DMPs)在CGIs和启动子中很少,但在open sea和基因体中很多。我们还在基因体中发现了与基因过表达相关的一组高甲基化CpG位点。

由于分析基因组中的甲基化有很大的价值,许多检测甲基化的方法和技术得以开发。甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)是一种终点分析技术[6,7];之后,第二代基于PCR的技术——MethyLight(定量MSP)被用来进行定量检测[8-10]。使用基于AluC4对照反应的MethyLight技术,已被广泛用于检测组织样品中CGI的甲基化[11,12]。然而,所有这些现有的DNA甲基化检测技术都要求待测位点位于具有成簇CpG二核苷酸的区域,例如CpG岛,以允许设计的引物和探针覆盖足够多的CpG位点,检测的也并非是这一位点,而是被引物和探针覆盖的全部CpG位点共甲基化的状况,然而,现有技术存在以下问题:

(1)无法准确检测基因组中存在的杂合甲基化。如果相邻CG位点未表现为共甲基化现象,在此区域无法成功设计qMSP技术所需的引物和探针。

(2)无法检测CpG岛以外区域的甲基化水平。基因组中CpG岛以外区域包括opensea、CpG shore等区域,主要位于gene body和基因间区,此区域CG 位点较少,很少存在相邻的CG位点,在此区域无法设计qMSP技术所需的引物和探针。

(3)甲基化水平的绝对定量依赖甲基化标准品,如果要获取某位点甲基化水平的绝对值,需同时设置100%甲基化标准品,通过样品和标准品的比值计算甲基化百分比参数(percentage of methylation ratio,PMR)。若甲基化标准品生产批次不同或存在不可避免的质量缺陷,如CG位点未100%甲基化、m5C自发脱氨基转化为C、DNA降解等,将造成甲基化水平绝对值定量的严重误差。

目前的甲基化检测均是针对CpG岛的甲基化位点检测,除非采用测序(亚硫酸氢盐焦磷酸测序),才可以检测这样的位点,但是它在大样本的队列验证中不具有成本-效益优势。

而MSP和MethyLight都不能分析主要分布在基因体内的open sea等区域中,侧翼序列CpG位点的孤立CpG位点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲基化检测试剂盒及检测方法。

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