[发明专利]一种DNA甲基化检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将DNA样品的非甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变；

b)用至少一对引物和至少一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针扩增步骤(1)转化后的DNA样品；其中，所述的寡核苷酸探针结合MGB；

c)分析扩增产物，并从扩增产物的存在性分析待测DNA的甲基化状态。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CpG位点为杂合甲基化区域的CpG位点，或者是侧翼没有CpG的孤立的CpG位点，或者共甲基化区域的CpG位点；或者是非共甲基化区域的CpG位点；

或者优选地，所述的CpG位点为CpG岛外的CpG位点，或者是CpG岛内的CpG位点；

或者优选地，所述的CpG位点位于基因体、基因间区或启动子；

更优选地，所述的CpG位点位于基因体或基因间区的CpG open sea、CpG shore、CpGshelf。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，采用转化剂进行转化，所述的转化剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种；

优选地，所述的转化剂为亚硫酸氢盐。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的引物扩增的长度为50～200bp。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针，其中一条特异性结合CG序列，另一条特异性结合TG序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针为一对Taqman探针，每条Taqman探针的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭剂和MGB基团，且两条Taqman探针5’末端连接的荧光基团具有不同发射光波长。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于每一条Taqman探针，所述的荧光基团选自FAM、VIC、ROX、TAMRA、SYTO9、JOE/TET/HEX、Texas Red和NED/BODIPY/TMR-X中的任意一种；

优选地，所述的淬灭剂选自NFQ、BHQ1和BHQ2中的一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，探针的长度在10～20bp之间；优选地，探针的长度在12～18bp之间。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的待测CpG位点位于探针中间靠3’端的区域；优选地，CpG位点位于靠探针3'端的三分之一区域；

优选地，探针5’端靠近正向引物的3’端。

10.根据权利要求1所述的方法，当同时检测多个孤立的CpG位点时，每个CpG位点含有与之相应的一对引物和一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针，且每个待测CpG位点的引物扩增区域不重叠。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，通过甲基化百分比参数PMR分析待测DNA的甲基化状态；

优选地，所述的甲基化百分比参数PMR为甲基化/(甲基化+非甲基化)×100；

更优选地，所述的甲基化百分比参数PMR＝甲基化荧光值/(甲基化荧光值+非甲基化荧光值)×100；

还更优选地，所述的甲基化百分比参数PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT_{甲基化荧光}–CT_{非甲基化荧光}。