[发明专利]一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法，将磷脂酶D基因置于严谨型启动子控制下，在表达质粒中插入pSC101的par区域，同时使用大肠杆菌recA突变株保持质粒的遗传稳定，生长期富集含质粒的细胞培养至高密度，诱导期饱和诱导，同时降低温度和施加碱金属盐胁迫，缓解PLD对宿主的细胞毒性，抑制细胞裂解，延长PLD的合成时间，从而提高PLD的表达。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌生产磷脂酶D的方法。

背景技术

磷脂酶D(EC 3.1.4.4，PLD)，以磷脂为底物，作用于磷酸二酯键，根据受体的不同(水和醇)，发生水解反应和转磷脂酰反应。其中，通过转磷脂酰反应，底物磷脂中可以引入各种各样的醇基，生成多种生物活性和药用价值的磷脂，被广泛用于食品和制药行业。例如当底物为磷脂酰胆碱(PC)，受体为丝氨酸、甘油和乙醇胺时，PLD分别转化PC为磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)(and Iwasaki 2013)。其中，随着人口老龄化到来，PS作为脑健康营养补充剂，受到持续的关注，并相继被美国FDA、日本HBM和中国国家卫生计生委所认证。相较于提取自牛脑和植物的PS，以大豆PC为底物通过PLD生物酶法制备的PS，避免了食品安全和植物源含量低的问题(Moré et al.2014)。进一步，一些新的结构和功能磷脂，通过PLD转磷脂酰反应被合成出来，例如，磷脂酰鲨肝醇(Arranz-Martínez et al.2017)、磷脂酰葡萄糖(Song et al.2012)、心磷脂类似物(Muller et al.2012)、磷脂酰酪醇(Yamamoto et al.2011；Casado et al.2013)、磷脂酰萜烯(Yamamoto et al.2008a；Yamamoto et al.2008b；Gliszczyńska et al.2016)和磷脂酰丝氨醇(Dippe et al.2008)，他们中一些具有抗癌和抗氧化活性。

工业应用和实验室研究中，用于转磷脂酰反应的PLD主要来自植物(黄瓜、卷心菜和花生)和放线菌(主要为链霉菌)。相较其它来源，它们显示出较高的转磷脂酰反应活性，而且来源易得。Dippe等(Dippe et al.2008)比较了PLD_cab(来源卷心菜)和PLD_str(来源Streptomyces sp.)催化合成不同极性头磷脂的收率和纯度；在所有的反应中，相较PLD_cab，PLD_str显示出明显更高的转磷脂酰反应活性。

受限于磷脂酶D来源不足和价格高(链霉菌属PLD，≥150units/mg，6516.9￥/1000U，Sigma)，其工业上的广泛应用受到制约。目前PLD的最高产量由日本学者Ogino等(Ogino et al.2004)在2004年通过基因工程技术在重组变铅链霉菌分泌表达获得，达5.5×10⁴U·L^-1(118mg·L^-1)；国内，2013年，张莹(张莹2013)借鉴相似的技术，在重组变铅链霉菌获得相当的表达量(58U/mL)；最近5年，国内其他研究者选育优良菌株和优化培养基，PLD的产量在10³U·L^-1左右。而在大肠杆菌和酵母表达系统，重组PLD表现出严重的细胞毒性，引起质粒不稳定、细胞裂解、合成时间短和酶泄露的问题，难以实现高密度发酵表达(Iwasaki et al.1995；Mishima et al.1997；Zambonelli et al.2003)。

发明内容