[发明专利]冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法，该培养试剂盒包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN‑γ制得；第二培养液由无血清免疫细胞培养液中加入CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体、rhIL‑1和rhIL‑2制得；第三培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物制得；第四培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物和rhIL‑2制得。和现有技术相比，本发明能够培养冻存后的细胞，扩增效果良好，且无其它外源性蛋白，避免了临床应用时的免疫排斥反应，培养的CIK细胞杀伤效果良好，用于临床肿瘤防治时安全可靠。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法。

背景技术

肿瘤是机体在各种致癌因素的作用下，局部组织的某一个细胞失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物，这种新生物多呈占位性块状突起。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。肉眼观察肿瘤的形态多种多样，并可在一定程度上反映肿瘤的良恶性。医学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。良性肿瘤生长缓慢，细胞的异型性不明显，一般与其来源组织相似。恶性肿瘤生长迅速，细胞常具有明显的异型性。近年来，恶性肿瘤治疗又出现了新方法，即细胞免疫治疗。细胞免疫治疗，是除放疗、化疗、手术治疗外地又一新方法。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。CIK(cytokine-induced killer，中文名：多种细胞因子诱导的杀伤细胞)是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一群异质细胞群，其中CD3+，CD56+淋巴细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；诱导肿瘤细胞凋亡；通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞，但这种效应细胞在正常外周血中极其少见，仅为1％～5％。

效应细胞的数量是影响肿瘤防治效果的关键因素之一，体外研究显示随着这种效应细胞与肿瘤细胞比例的增加，免疫细胞对肿瘤的杀伤效果呈线性增加。每次增加回输免疫细胞的数量，可显著改善患者自体抗肿瘤细胞免疫功能。由此可见，如何获得足够数量的、免疫活性强的效应细胞是保证治疗效果的必备条件。

细胞免疫治疗主要是采集患者自身外周血，通过分离和收集得到外周血单个核细胞。但一般说来，接受细胞免疫治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染患者，然而此类人群的免疫细胞机能已十分低下，分离出的免疫细胞活性较低；而异体的免疫细胞移植则可能引起患者体内的免疫排斥反应。因此，利用冻存技术将健康状况良好、免疫细胞活性较强时的细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，以备将来治病之需。目前常用的储存方法是利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞，虽然现在已经研究出多种不同的冻存液配方，但是仍然会使冻存后细胞活性降低，导致细胞复苏后很难恢复活性，且复苏后培养困难，细胞扩增效率不高，从而使临床上很难得到足够数量的细胞。

发明内容

本发明针对现有冻存液配方的缺点，提出一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法，用以解决现有技术存在的上述问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒，包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；

所述复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；

所述第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN-γ制得；