[发明专利]冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法

权利要求书

1.一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒，其特征在于，包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；

所述复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；

所述第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN-γ制得；

所述第二培养液由无血清免疫细胞培养液中加入CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体、rhIL-1和rhIL-2制得；

所述第三培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物制得；

所述第四培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物和rhIL-2制得。

2.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述的复苏液中人血清白蛋白的质量百分数浓度为5％。

3.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第一培养液中rhIFN-γ的质量百分数浓度为100-1000ng/mL。

4.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第二培养液中CD3单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、CD28单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、rhIL-1的质量百分数浓度为50-200ng/mL及rhIL-2的质量百分数浓度为50000-100000U/mL。

5.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第三培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％。

6.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第四培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％和rhIL-2的质量百分数浓度为200-1000U/mL。

7.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述无血清免疫细胞培养液为AIM-V培养基、RPMI1640培养基或X-VIVO培养基。

8.一种冻存PBMC诱导CIK细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1-7任一项所述的培养试剂盒进行扩增培养，包括以下步骤：

步骤一、PBMC的复苏：将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，将冻存管置于水浴中以使冻存管中冻存的PBMC融解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中，混匀后进行洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用所述第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中；

步骤二、复苏PBMC诱导CIK细胞培养：对步骤一中培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养；

步骤三、培养24h后将第三培养液添加到培养瓶中，并摇晃混匀；

步骤四、将上述步骤三中培养瓶中摇晃混匀的培养液继续培养13天或14天，每隔3天补充第四培养液以使免疫细胞的密度分别为0.2×10⁶/mL、0.6×10⁶/mL、1.2×10⁶/mL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤一具体是：

将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，再将所述冻存管置于37℃恒温水浴中以使冻存管中冻存的PBMC溶解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中混匀，混匀后进行洗涤再离心10min，将洗涤离心后的PBMC用所述第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤二具体是：

将第二培养液添加到步骤一中的细胞悬液中，放入温度为37℃、CO₂的体积百分比浓度为5％的培养箱中进行诱导扩增培养。