[发明专利]一种复合启动子及其在提高肺炎克雷伯氏杆菌的3-羟基丙酸产量中的应用

权利要求书

1.一种重组载体在提高肺炎克雷伯氏杆菌的3-羟基丙酸产量中的应用，其特征在于，所述重组载体是含有复合启动子和puuC醛脱氢酶基因的pET-28a重组载体，其中复合启动子的序列如Seq ID No.3所示，puuC醛脱氢酶基因序列如Seq ID No.6所示；所述重组载体的制备方法如下：

1)用限制性内切酶BglII/EcoRI分别对复合启动子和pET-28a载体进行双酶切；

2)电泳，琼脂糖凝胶回收酶切后的复合启动子片段和pET-28a载体片段；

3)使用连接酶将复合启动子片段和pET-28a载体片段连接，得到含有复合启动子片段的载体；

4)PCR扩增puuC醛脱氢酶基因序列；

5)用限制性内切酶Sac I/EcoR I分别对步骤3)制得的含有复合启动子片段的载体和步骤4)制得的puuC醛脱氢酶基因进行双酶切；

6)电泳，琼脂糖凝胶回收酶切后的含有复合启动子的载体片段和puuC醛脱氢酶基因片段；

7)使用连接酶将含有复合启动子的载体片段和puuC醛脱氢酶基因片段连接，得到重组载体。

2.一种生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，将含有复合启动子和puuC醛脱氢酶基因的pET-28a重组载体转化至肺炎克雷伯氏杆菌，经筛选获得肺炎克雷伯氏杆菌重组菌，对重组菌进行发酵，从发酵液中获得3-羟基丙酸；

所述复合启动子的序列如Seq ID No.3所示，puuC醛脱氢酶基因序列如Seq ID No.6所示；

发酵时保持温度在37℃，自动流加酸碱使pH维持在7.0，通气量为1.5vvm，搅拌转速为400 rpm，甘油浓度维持在20g/L以上，所用发酵培养基配方如下：KH₂PO₄ 2.7g/L、NH₄NO₃2.4g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、CaCO₃ 0.15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.12g/L、NaH₂PO₄ 1.6g/L、EDTANa₂ 0.001g/L、柠檬酸0.06g/L；甘油40g/L、酵母粉4g/L、微量元素1.25mL/L，其中微量元素溶液的组成如下：Na₂MO₄·2H₂O 0.045g/L、FeSO₄·7H₂O 1.7g/L、CoCl₂·2H₂O 0.12g/L、ZnCl₂ 0.05g/L、NiCl₂·6H₂O 0.025g/L、H₃BO₃ 0.16g/L、MnCl₂·4H₂O0.1g/L、CuCl₂·2H₂O 0.06g/L、37%HCl 3.6mL。