[发明专利]一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒，属于农药检测技术领域。所述试剂盒包括如下组成：胶体金探针溶液、磁性纳米探针溶液、磁分离装置、洗液、微滴发生器、PCR引物对、PCR探针和PCR Mix液；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述生物条形码利用所述PCR引物对扩增得到；所述PCR探针的核苷酸序列与所述生物条形码的部分序列互补配对；所述磁性纳米探针为表面修饰有机磷农药抗原的磁球。本发明提供的试剂盒利用生物条形码进行信号放大，同时利用数字PCR绝对定量，能显著提高检测灵敏度。

技术领域

本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用。

背景技术

三唑磷农药是一种光谱性的有机磷杀虫剂，杀螨剂。三唑磷农药已在2016年12月31日禁止在蔬菜中使用，并且日本规定稻米中三唑磷的最大残留限量(MRL)为不得检出；欧盟除茶叶为0.05mg/kg、棉籽0.1mg/kg外，其余样品为0.02mg/kg；我国三唑磷的最大残留限量一般都限定为0.05mg/kg。因此加强对于三唑磷的残留检测方法具有重要意义。

相对于GC-MS/MS，LC-MS/MS，GC等方法来说，免疫分析方法具有快速简便，不需要专门的技术人员，价格成本低等优点，免疫分析方法主要包括荧光免疫分析，酶联免疫分析，化学发光免疫分析，生物条形码免疫分析。生物条形码免疫分析方法以其高灵敏度在近几年迅速发展。数字PCR技术是一种可以对待检物进行绝对定量分析的技术。在1992年，Sykes等在正常体细胞和非淋巴细胞背景下检测白血病细胞时提出要将体系进行有限稀释，终点信号的有无，根据泊松分布的原理处理数据。在当时并没有提出数字PCR的概念，但是却为数字PCR的产生奠定了基础。在1999年，Vogelstein等正式提出了数字PCR的概念。DeborahPersaud等利用微滴式数字PCR技术确认全球首例HIV感染患儿功能性治愈冯兆民等基于微滴式数字PCR技术对甲型流感病毒进行检测。数字PCR以及广泛应用于基因表达分析，临床诊断，转基因成分定量，微生物检测等方面的应用，现阶段还没有关于农药等小分子物质的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用，提高检测灵敏度。

本发明提供了一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：胶体金探针溶液、磁性纳米探针溶液、磁分离装置、洗液、微滴发生器、PCR引物对、PCR探针和PCR Mix液；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述生物条形码利用所述PCR引物对扩增得到；所述PCR探针的核苷酸序列与所述生物条形码的部分序列互补配对；所述磁性纳米探针为表面修饰有机磷农药抗原的磁球。

优选的，生物条形码的修饰方法通过固定在金纳米粒子表面的生物条形码互补链互补配对实现。

优选的，所述生物条形码的序列如SEQ ID No.1所示；所述PCR引物对包括扩上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的序列如SEQ IDNo.3所示；所述PCR探针的序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述胶体金探针溶液中特异性单克隆抗体的浓度为40～50mg/L；所述胶体金探针溶液中生物条形码的浓度为1～3μmol/L；所述磁性纳米探针溶液中抗原的浓度为70～80mg/L；

优选的，所述有机磷农药包括三唑磷，所述有机磷农药抗原包括三唑磷半抗原与OVA偶联形成的完全抗原，所述特异性单克隆抗体包括抗三唑磷单克隆抗体。

优选的，所述金纳米粒子的粒径≤0.22μm；所述洗液为0.005～0.015mol/L的pH值为7～8的PBS缓冲液。

优选的，所述试剂盒中还包括有机磷农药标准品。