[发明专利]一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于数字PCR的有机磷农药残留生物条形码免疫分析试剂盒，其特征在于，由如下物质组成：胶体金探针溶液、磁性纳米探针溶液、磁分离装置、洗液、微滴发生器、PCR引物对、PCR探针和PCRMix液；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和特异性单克隆抗体的金纳米粒子，制备胶体金探针时的封闭时间为30min；所述生物条形码利用所述PCR引物对扩增得到；所述PCR探针的核苷酸序列与所述生物条形码的部分序列互补配对；所述磁性纳米探针为表面修饰有机磷农药抗原的磁球，磁性颗粒与半抗原-OVA的偶联物的封闭时间为40min；

所述有机磷农药为三唑磷，所述有机磷农药抗原为三唑磷半抗原与OVA偶联形成的完全抗原，所述特异性单克隆抗体为抗三唑磷单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，生物条形码的修饰方法通过固定在金纳米粒子表面的生物条形码互补链互补配对实现。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物条形码的序列如SEQ ID No.1所示；所述PCR引物对包括扩上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.3所示；所述PCR探针的序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金探针溶液中特异性单克隆抗体的浓度为40～50mg/L；所述胶体金探针溶液中生物条形码的浓度为1～3μmol/L；所述磁性纳米探针溶液中抗原的浓度为70～80mg/L。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述金纳米粒子的粒径≤0.22μm；所述洗液为0.005～0.015mol/L的pH值为7～8的PBS缓冲液。

6.根据权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括有机磷农药标准品。

7.权利要求1～6任一项所述试剂盒在检测有机磷农药残留中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测有机磷农药残留的方法包括如下步骤：

(1)将胶体金探针溶液与待测样品和磁性纳米探针溶液混合，37℃孵育0.5～2h，得到反应液；

(2)将反应液用磁分离装置吸附后，弃去溶液，用洗液进行洗涤，得到磁性纳米探针和胶体金探针的复合物；

(3)将所述步骤(2)得到的磁性纳米探针和胶体金探针的复合物置于50～65℃水中震荡解离0.5～2h，得到生物条形码溶液；

(4)以所述步骤(3)中得到的生物条形码溶液为扩增模板，用PCR引物对和PCRMix液配制PCR反应体系；

(5)将所述PCR反应体系利用微滴发生器进行数字PCR扩增，得到生物条形码的绝对定量结果；

(6)以有机磷农药标准品为待测样品，按步骤(1)～(5)的方法测定绝对定量结果，将有机磷农药标准品浓度的log值与抑制率绘制成标准曲线，计算得到标准方程式；

(7)将所述步骤(5)得到的生物条形码量绝对定量计算得到的抑制率代入标准方程式中，计算得到有机磷农药残留量；

所述步骤(6)和步骤(1)～(5)之间没有时间顺序的限制。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中PCR反应体系包括10μL的PCR Mix液，2μL模板，1μL 200～300nmol/L的上游引物，1μL 200～300nmol/L的下游引物，0.5μL 100～150nmol/L的PCR探针和5.5μL的ddH₂O；所述步骤(5)中数字PCR扩增的反应程序为：95℃，8:00；94℃，30s，57℃，40s，40个循环；98℃，8:00；4℃hold。