[发明专利]一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。本发明易错DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，得到易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；(2)克隆SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；(3)将核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21中，获得表达菌株；(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16‑20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提高了易错DNA聚合酶表达和纯化效率，以获得稳定、高活力的易错DNA聚合酶，提高易错效果。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。

背景技术

PCR是一种DNA片段体外复制技术，但常有一定的碱基错配发生，一般错配率为10^-6～10^-5。 碱基错配虽然降低了DNA序列复制的保真性，但对获得新DNA序列提供了一种可利用的突破 口。易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的碱基错配率，从而获得与原来不同的DNA 序列或基因。易错PCR作为一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，主要是针对特定的 基因，这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。易错PCR技术是采用多种方法提高 DNA聚合酶的碱基错配率，并稳定非互补碱基对。改变PCR反应条件的方法主要有4种，一 是使用低保真度Taq酶、并加大Taq酶用量；二是调整反应体系中4种dNTP的浓度，使之 非1∶1∶1∶1的平衡浓度关系；三是在反应体系中加入一定量的Mn²⁺；四是增加反应体系中 的Mg²⁺浓度。此外，降低起始模板浓度、增加每个循环的延伸时间、提高反应体系pH值、增加循环次数等也都可以明显提高诱变率。几种方法可单独使用，但更多的时候是综合使用，以求最简单、快捷的得到更多的突变子。

以上的易错PCR研究全部采用改变PCR反应条件，来提高DNA聚合酶错误率的方法进行， 但易错PCR产量和变异水平偏低。较低的模板浓度以及引物与模板结合严格性的降低，使得 目标片段的产量偏低由于碱基变异偏好、转换高于颠换，造成变异谱较窄，筛库得到有益基 因的概率降低。三是对模板的要求较高，最好是只含目的基因的DNA片段。另外，应用易错 PCR时一般都要针对具体基因进行诱变条件的优化，需要优化的条件有多个，包括Mn²⁺浓度、 Mg²⁺浓度、4种dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度、延伸时间、循环次数等，这些条 件综合起来优化还比较费力。为了解决这些问题，有人尝试通过修饰DNA聚合酶来提高常规 PCR错配率的研究。Benjamin和Connolly于2004年报道了一个PfuDNA聚合酶的变种在易错PCR反应中表现出极好的性能。Pfu DNA聚合酶有两个螺旋构成了聚合酶的指状子域，这一 区域负责将碱基与模板链正确地互补配对。当两个螺旋之间的关键氨基酸发生变异，与缺失 3'-5'核酸外切酶活性同时发生时，一个高保真野生型聚合酶就变为了一个低保真聚合酶。这 个PfuDNA聚合酶变种能够在标准PCR反应条件下用于诱变基因，并得到高频率、几乎没有任 何倾向的变异。

发明内容

为了解决易错PCR时操作的繁琐及条件的优化，本发明提供一种编码易错DNA聚合酶及 其制备方法。该方法可以得到高纯度易错DNA聚合酶。

本发明是为实现上述技术目的而采取的技术方案为：

一种编码易错DNA聚合酶，所述编码易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示， 基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明易错DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，得到易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；