[发明专利]一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法

权利要求书

1.一种易错DNA聚合酶，其特征在于，所述易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，获得易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：2；

(2)克隆SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；

(3)将步骤(2)所得的核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；

(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21中，获得表达菌株；

(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，37℃培养4.5h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述步骤(1)中所述的提取红球菌基因组DNA的方法为：采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA；所述的比对方法为：经华大基因测序，注释，通过blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全长为3252bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码1123个氨基酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。

3.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的表达菌株的具体获得方法为：通过PCR进行易错DNA聚合酶基因的扩增，扩增引物为SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物和pET32a质粒进行EcoRI和NotI双酶切，电泳，回收，将目的片段易错DNA聚合酶基因和pET32a进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒命名为pET32a-error Taq，将重组质粒转化入感受态E.coli BL 21中，获得表达菌株。

4.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述裂解菌体是采用溶菌酶裂解。

5.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述纯化是由热变性沉淀和层析柱分离纯化两步组成。

6.根据权利要求4所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述溶菌酶裂解时采用的溶菌酶浓度为0.2-0.4mg/mL。

7.根据权利要求5所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述层析柱为镍柱亲和层析。

8.根据权利要求5所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述热变性为裂解菌体采用溶菌酶裂解后，上清液80℃加热30分钟；离心，所得上清液进行镍柱亲和层析。