[发明专利]一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法

说明书

本发明公开的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，包括以下步骤：步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出样品的DNA；步骤2，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增；步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列；步骤4，基于得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。本发明鉴定活血丹品种的方法通过改良干药材DNA提取方法和特异性PCR扩增反应条件，为活血丹药材的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中药材中准确快速地检测出活血丹及其易混品，提高了检测的准确度，适于广泛推广应用。

技术领域

本发明属于植物品种鉴定方法技术领域，具体涉及一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法。

背景技术

活血丹(Glechoma longituba(Nakai)Kupr.)为唇形科多年生草本植物，又名连钱草、地钱儿、遍地金钱、透骨风、过墙风、九里香等，茎高10～20cm、四棱形；叶对生、圆形或肾形；轮伞花序腋生，每轮有花2～6朵；小坚果，果期4～5月。活血丹喜阴湿，生长于林间草地、河畔或田野等地。其干燥地上部分入药，药材名为连钱草(《中国药典》(2010年版)收录)，主产于江苏、浙江一带，性微寒，味辛，入肝、肾、膀胱经，有清热解毒、利尿通淋、散瘀消肿的功能，主治胆囊炎、胆结石、肾结石、黄疸型肝炎等症。

活血丹属植物约有8种，广泛分布于欧、亚大陆温带地区，南北美洲有栽培。我国有5种2变种(中国植物志)，即活血丹Glechoma longituba(Nakai) Kupr.，据《中国植物志》记载，活血丹除青海、甘肃、新疆及西藏外，全国各地均产；白透骨消Glechoma biondiana(Diels)C.Y.Wu et C.Chen.，分布于陕西、甘肃、河南、河北；欧活血丹Glechoma hederaceaL.，在我国产于新疆一带，国外产于北欧、西欧、中欧各国；日本活血丹Glechoma grandis(A. Gray)Kupr.，国内产于江苏、中国 台湾，国外产于日本；大花活血丹Glechomasinograndis C.Y.Wu，别名大筋草，产于云南一带，海拔2000～2900m。变种为无毛白透骨消Glechoma biondiana(Diels)C.Y.Wu et C.Chen var. glabrescens C.Y.WuC.Chen，国内分布于甘肃、陕西、河北等省区；狭萼白透骨消G.biondiana var.angustituba C.Y.Wu etC.Chen分布于湖北、四川，海拔1200～1650m。

由于活血丹与其同属植物的植株形态相似，传统的形态学手段不能保证基源鉴定的准确性。活血丹及其易混药材的鉴别对于植物资源保护及用药安全都具有重要的意义。随着分子生物学的发展，条形码技术作为一种前沿的分子标记技术应用于多种中药材鉴别上。本发明以ITS2序列为条形码，运用生物信息学的方法准确鉴别活血丹及其同属植物，为条形码技术在活血丹鉴定中的应用提供理论及方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，解决了现有鉴定方法准确度低的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，包括以下步骤：

步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的 DNA；

步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；

步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列；

步骤4，基于步骤3得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。

本发明的特征还在于，

步骤1具体为：