[发明专利]一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法

权利要求书

1.一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的DNA；

步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理

取待鉴定活血丹干叶片3-4片于离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；

步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中加入550uL的CTAB，置于65℃干浴加热至少30min，加热期间颠倒混匀后放置10min，冷却至室温；

步骤1.3，在步骤1.2的溶液中加入450uL的酚氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min分层，得到上层液体；

步骤1.4，吸取450uL步骤1.3的上层液体至离心管，加入与上层液体等体积的氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min，静置分层得到上清液；

步骤1.5，吸取步骤1.4中300uL的上清液至离心管，加入与上清液等体积的预冷至-20℃的异丙醇，上下解倒混匀后，放置于温度-20℃条件下至少10min，随后14000rpm条件下离心10min，静置，去掉上层清液，得到下层白色沉淀；

步骤1.6，在步骤1.5的下层白色沉淀中加入500uL预冷至-20℃的体积分数为70％的乙醇，轻弹管壁，悬浮沉淀，14000rpm条件下离心2min，静置分层，再次去掉上层清液，下层沉淀于室温条件下挥发乙醇至干燥；

步骤1.7，在步骤1.6干燥的下层沉淀加入80ul TE，于14000rpm条件下离心1min，并于4℃保存，得到待鉴定活血丹样品的DNA，备用；

步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；

PCR扩增的反应体系为：

2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物ITS2F和ITS3R均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA 1ul，ddH₂O 9.5ul；

PCR反应扩增引物为：

ITS2F：5’-ATCGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，

ITS3R：5’-ATCGGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；

步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列，rDNA ITS2的序列的基因编码如序列1所示；

步骤4，基于步骤3得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。

2.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增的反应条件为：

温度94℃，变性2min；温度94℃变性30s，温度56℃退火30s，温度72℃延伸45s，40个循环；温度72℃延伸2min。

3.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序仪具体为ABI3730xl DNA Analyzer测序仪，

步骤3具体操作为：

将得到的rDNA ITS2序列经Seqman软件拼接校对，随后通过隐马尔科夫模型进行ITS2序列注释。

4.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤4具体为：将步骤3得到的rDNA ITS2序列使用MEGA7.0软件进行数据分析，构建Neighbor-Joining Tree，最后通过对NJ树分析，鉴别活血丹品种。