[发明专利]一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法在审
| 申请号： | 201810824552.2 | 申请日： | 2018-07-25 |
| 公开（公告）号： | CN108866046A | 公开（公告）日： | 2018-11-23 |
| 发明（设计）人： | 赵卓;李萍;张绍峰;康伟;苏加忱;李淑君;马南;王绍成;吕志 | 申请（专利权）人： | 辽宁润基生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12N5/00 |
| 代理公司： | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 | 代理人： | 李颖 |
| 地址： | 110000 辽宁省沈阳市经济*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 游离核酸 纯化柱 羟基磷灰石 核酸 样本 羟基磷灰石吸附 生物检测技术 预处理样本 分离纯化 活化状态 洗脱样品 高纯度 平衡液 洗涤液 洗脱液 液处理 柱平衡 血清 活化 去除 洗涤 试验 应用 | ||
1.一种同时分离、纯化外泌体和/或游离核酸的方法，其特征在于，
S1.利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态；
S2.利用样本平衡液预处理样本；
S3.将上述处理后样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化外泌体及游离核酸；
S4.利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用不用浓度的洗脱液分别洗脱样品中的外泌体和/或游离核酸。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM Na3PO4，pH为6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样本处理为将样本上清液与样本平衡液等体积混匀。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述样本平衡液液为50-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5，即可同时或分别分离、纯化外泌体及游离核酸。
5.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述步骤S3为将步骤S2处理后样本加入步骤S1平衡后的羟基磷灰石纯化柱，室温孵育10-60min后,4℃，2000-5000rpm离心1-5min，弃滤液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样本为细胞培养液或生物体液；
其中，当样本为细胞培养液预处理为：细胞培养液在4℃，12000g离心20min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡；
当样本为生物体液预处理为：生物体液在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于,所述步骤S4将洗涤液加入纯化柱中，孵育1-5min,4℃，2000-5000rpm离心1-5min，弃滤液,重复一次。
8.根据权利要求1或7所述方法，其特征在于，洗涤液为1-10mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA；200mM-1M NaCl，pH为6.5-7.5。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述经洗涤后纯化柱用含50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体；
所述洗涤后用含200-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度游离核酸；
所述洗涤后先用含50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体；再用含200-500mMNa3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度游离核酸，即可同时分离纯化外泌体和游离核酸。
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