[发明专利]一种基因工程细胞及体外高效扩增NK细胞的方法

说明书

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种基因工程细胞和利用该基因工程细胞进行体外高效扩增NK细胞的方法。该基因工程细胞利用Piggybac转座子系统构建跨膜稳定表达IL‑15、IL‑18和4‑1BBL的K562工程化细胞，并采用细胞体外刺激技术，提供一种基于基因工程K562细胞扩增激活NK细胞的方法。该基因工程细胞能同时跨膜高表达IL‑15、IL‑18和4‑1BBL；本发明的NK细胞扩增方法操作简单、成本低，扩增的NK细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于NK细胞大规模制作，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种基因工程细胞和利用该基因工程细胞进行体外高效扩增NK细胞的方法。

背景技术

最新版的《世界癌症报告》对全球180多个国家的28种癌症的总体情况和流行趋势进行了全面的描述和分析，报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。其中，肺癌、胃癌、肝癌为发病率最高的癌症，而乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌使女性健康受到威胁。

肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。

NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫细胞，无需有抗体存在或者预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。NK细胞表达CD56但缺失CD3，通常用CD3-CD56+来标志和定义NK细胞。NK细胞对于不同来源的肿瘤细胞都具有很强的杀伤作用，在肿瘤的免疫细胞治疗方面有着良好的发展和应用前景。NK细胞在外周血中约占淋巴细胞的5％-10％，所占比例很少。如何获得足够数量的高杀伤性的NK细胞是NK细胞应用于临床的重要保证。外周血中分离出来的高纯度的NK细胞数量有限且增殖能力弱，在体外不给予其它影响因素的情况下，NK细胞增殖的效率和杀伤功能低下。

目前，体外促进NK细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养，也有研究者将K562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激NK细胞的生长。上述方法虽然能够刺激NK细胞高效扩增，但是动物血清成分复杂，取材过程中有可能带入支原体、病毒，对NK细胞培养造成不确定性以及不安全性。

因此，进一步开发一种能高效扩增且保证NK细胞增殖速度和肿瘤细胞杀伤效果的NK细胞方法十分必要。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基因工程细胞及体外高效扩增NK细胞的方法，该基因工程细胞能同时高表达IL-15、IL-18和4-1BBL；采用本发明的方法不仅可以高效地扩增人NK细胞，而且还可以增强NK细胞的杀伤力。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提出一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞，该基因工程细胞能跨膜稳定表达IL-15、IL-18和4-1BBL。

本发明的第二个目的在于提出一种上述基因工程细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别构建重组IL-15表达转座子、重组IL-18表达转座子和重组4-1BBL表达转座子；

(2)重组IL-15表达转座子与转座酶共转染K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15跨膜稳定表达的IL-15-K562细胞；