[发明专利]一种基因工程细胞及体外高效扩增NK细胞的方法

权利要求书

1.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞，该基因工程细胞能跨膜稳定表达IL-15、IL-18和4-1BBL。

2.一种如权利要求1所述基因工程细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别构建重组IL-15表达转座子、重组IL-18表达转座子和重组4-1BBL表达转座子；

(2)重组IL-15表达转座子与转座酶共转染K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15跨膜稳定表达的IL-15-K562细胞；

(3)重组IL-18表达转座子与转座酶共转染IL-15-K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15、IL-18跨膜稳定表达的IL-15-IL-18-K562细胞；

(4)4-1BBL表达转座子与转座酶共转染IL-15-IL-18-K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15、IL-18和4-1BBL跨膜稳定表达的IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞。

3.根据权利要求2所述的一种基因工程细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中分别使用PiggyBac转座子系统构建重组IL-15表达转座子、重组IL-18表达转座子和重组4-1BBL表达转座子；具体方法是：分别PCR扩增IL-15、IL-18和4-1BBL基因，然后分别将扩增产物插入Piggybac睡美人表达载体的XbaI-BamHI位点，分别构建对应的重组IL-15表达转座子、重组IL-18表达转座子和重组4-1BBL表达转座子，其中IL-15，IL18带有CD8TM跨膜区。

4.根据权利要求3所述的一种基因工程细胞的制备方法，其特征在于，所述Piggybac睡美人表达载体中含有人自身的EF1α启动子和选择标记基因。

5.权利要求1所述的基因工程细胞的应用，其特征在于，所述基因工程细胞应用于体外扩增NK细胞。

6.一种基于权利要求1中所述基因工程细胞的体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建能跨膜稳定表达IL-15、IL-18和4-1BBL的基因工程细胞IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞；

(2)丝裂霉素C处理步骤(1)获得的IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞后，用NK细胞扩增培养液洗涤细胞若干次后，用含有10％自体血浆的NK细胞扩增培养液重悬细胞，制作成细胞悬液备用；

(3)将步骤(2)中的灭活IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞悬液与PBMC细胞混合，在NK细胞扩增培养液中共培育；

(4)根据细胞状态及培养基颜色变化，2～3天进行半换液，以获得足够量的NK细胞。

7.根据权利要求6所述的一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞是通过以下步骤制备的：

(1)分别构建重组IL-15表达转座子、重组IL-18表达转座子和重组4-1BBL表达转座子；

(2)重组IL-15表达转座子与转座酶共转染K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15跨膜稳定表达的IL-15-K562细胞；

(3)重组IL-18表达转座子与转座酶共转染IL-15-K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15、IL-18跨膜稳定表达的IL-15-IL-18-K562细胞；

(4)4-1BBL表达转座子与转座酶共转染IL-15-IL-18-K562细胞，并培养转染后的细胞，经细胞分选，获得IL-15、IL-18和4-1BBL跨膜稳定表达的IL-15-IL-18-4-1BBL-K562细胞。