[发明专利]茶树四重荧光SSR分子标记检测方法

说明书

本发明公开了茶树四重荧光SSR分子标记检测方法，通过引物组合、降落PCR、毛细管荧光电泳等技术的组合，建立了一套茶树四重SSR分子标记检测方法，本方法不仅可以提高茶树SSR分子标记研究效率和准确性，而且可以节约劳力。而目前的茶树SSR分子标记检测主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，存在分辨率低、误差大、效率低等不足，本发明提供的四重SSR分子标记检测方法，该方法一次可以完成4对SSR引物的检测。同时，免去了引物退火温度筛选、人工跑胶、人工读带等不足，不仅大大提高了工作效率，而且简便、迅速、准确，方法稳定、重复性好，可进行茶树品种鉴别、指纹图谱构建、群体遗传结构和遗传分化等研究。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及茶树四重荧光SSR分子标记检测方法。

背景技术

随着分子生物学技术的不断发展，特别是DNA分子标记技术的出现、发展及应用，对植物种质资源的研究起到了极大的推动作用。分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。分子标记的优越性表现为：(1)直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；(2)数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；(3)多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；(4)表现为中性，不影响目标性状的表达；(5)许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。由于以上特点使它在评价物种的遗传多样性上更为直接、可靠，极大地弥补了传统遗传标记如形态学标记、细胞学标记、生化标记的不足。分子标记已在茶树的遗传多样性、亲缘关系分析、分类学等方面的研究中得到了广泛的应用。SSR是目前茶树分子标记研究中应用最多的标记类型。而目前茶树SSR分子标记主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，每次只能完成1个标记的检测，因此操作复杂、效率低、灵敏度差。同时还要进行不同引物退火温度的筛选，影响了试验效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用的茶树四重荧光SSR分子标记检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供茶树四重荧光SSR分子标记检测方法，所述四重荧光SSR分子标记检测是在2个PCR反应体系中实现的，即体系I和体系II，其中各PCR反应体系中包含2组引物，每组引物对应于1个SSR位点，4组引物可实现对4个SSR位点的检测；其中，同一PCR反应体系中的2组引物的目的片段之间不能有重叠区域。

对于体系I，包括5个引物，分别为：荧光标记引物①，引物1和引物2的带尾正向引物，引物1和引物2的反向引物；其中引物1和引物2的带尾正向引物分别是指在引物1和引物2正向引物序列的5’端加上与荧光标记引物①相同的序列，但是不加荧光标记物；

对于体系II，包括5个引物，分别为：荧光标记引物②，引物3和引物4的带尾正向引物，引物3和引物4的反向引物；其中引物3和引物4的带尾正向引物分别是指在引物3和引物4正向引物序列的5’端加上与荧光标记引物②相同的序列，但是不加荧光标记物。

其中，2个荧光标记引物所含有的荧光标记物不同。

优选地，本发明中2个荧光标记引物的序列相同。

在本发明的一个具体实施方式中，所述茶树为湘波绿2号。

4组引物的序列见表1：

表1

所述PCR反应体系如下：