[发明专利]茶树四重荧光SSR分子标记检测方法在审
| 申请号： | 201810814644.2 | 申请日： | 2018-07-23 |
| 公开（公告）号： | CN108998551A | 公开（公告）日： | 2018-12-14 |
| 发明（设计）人： | 刘振;杨阳;赵洋;杨培迪;成杨;宁静 | 申请（专利权）人： | 湖南省茶叶研究所（湖南省茶叶检测中心） |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;黄爽 |
| 地址： | 410125 湖南省长沙市*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 茶树 检测 荧光 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 群体遗传结构 指纹图谱构建 茶树品种 工作效率 温度筛选 效率低等 引物退火 引物组合 荧光电泳 降落PCR 分辨率 毛细管 鉴别 遗传 分化 研究 节约 | ||
1.茶树四重荧光SSR分子标记检测方法，其特征在于，所述四重荧光SSR分子标记检测是在2个PCR反应体系中实现的，即体系I和体系II，其中各PCR反应体系中包含2组引物，每组引物对应于1个SSR位点，4组引物可实现对4个SSR位点的检测；其中，同一PCR反应体系中的2组引物的目的片段之间不能有重叠区域；
对于体系I，包括5个引物，分别为：荧光标记引物①，引物1和引物2的带尾正向引物，引物1和引物2的反向引物；其中引物1和引物2的带尾正向引物分别是指在引物1和引物2正向引物序列的5’端加上与荧光标记引物①相同的序列，但是不加荧光标记物；
对于体系II，包括5个引物，分别为：荧光标记引物②，引物3和引物4的带尾正向引物，引物3和引物4的反向引物；其中引物3和引物4的带尾正向引物分别是指在引物3和引物4正向引物序列的5’端加上与荧光标记引物②相同的序列，但是不加荧光标记物；
其中，2个荧光标记引物所含有的荧光标记物不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，2个荧光标记引物的序列相同。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述茶树为湘波绿2号；
4组引物的序列见表1：
表1
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系如下：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序如下：包括3个touchdown循环以及30个标准循环，起始变性温度为94℃3分钟；3个touchdown循环为94℃变性30秒，68℃退火50秒钟，每执行一个循环后退火温度降低2℃，72℃延伸50秒；30个标准循环为：94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒；完成以上循环以后，在72℃保持10分钟；最后将PCR产物冷却至室温或4℃保存。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，PCR反应结束后，将2个PCR产物按等比例混合，通过荧光毛细管电泳进行基因分型。
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