[发明专利]一种检测及定性大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法

权利要求书

1.一种检测及定性高脂血症大鼠血清中的带有金属铬的蛋白质的方法，所述的蛋白质为谷胱甘肽过氧化物酶Gpx-3和载脂蛋白ApoaI，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）二维电泳法分离血清蛋白质；

（2）ICP-MS检测金属蛋白；

（3）MALDI-TOF-MS鉴定金属蛋白；

步骤（1）包括高丰度蛋白的去除、蛋白的定量、一向等电聚焦电泳、二维SDS-PAGE、银染；

所述的一向等电聚焦电泳是将蛋白样品与水化上样缓冲液、4.5 mg 1％DTT、0.5％~1％两性电解质混合均匀，连续、线性地加入到聚焦盘中；

所述的二维SDS-PAGE的步骤是：取出IPG胶条，分别放入平衡缓冲液A和缓冲液母液B中作用10-15分钟，垂直向 SDS-PAGE 使用质量分数为12%的凝胶；

所述的平衡缓冲液A为：尿素6 M、甘油20%、SDS 2%、pH 8.8的Tris-HCl 0.375 M；

所述的缓冲液母液B为：0.4 g碘乙酰胺溶于10 mL超纯水；

步骤（2）中ICP-MS检测金属蛋白的步骤如下：切割蛋白点，同时切取一份不含蛋白点的空白凝胶，将称取的凝胶放置在消解罐中，加入1 mL硝酸，在电加热板上以160 -170 ℃加热溶解完全，冷却到室温，移至LEP管中，加水稀释至1.5 mL，混匀；测定Fe、Cu、Zn、Se、Cr，采用四级杆电感耦合等离子体质谱进行样品测定；

质谱测定样品前需进行手动调协，采用含1 ng/mL的Li、Y、Ce、Tl、Co混合标准溶液校准低质量数、中质量数和高质量数的质量峰位；

步骤（3）中MALDI-TOF-MS鉴定金属蛋白的步骤如下：

a、胶粒脱色；

将胶粒放置于适量脱色液中20-30 min后，用超纯水清洗至无色，所述脱色液的配制：100 mM的Na₂S₂O₃和30 mM的K₃(Fe(CN)₆)按1:1的比例混合均匀即得；

b 、胶内酶解；

将脱色的胶粒冻干，加入0.01 mg/mL的胰蛋白酶溶液，所述的胰蛋白酶溶液含50mMNH₄HCO₃, 5 mM CaCl₂，令胶块充分膨胀，然后于37℃水浴酶解15-16 h，用5%的TFA水溶液提取酶解肽段；

c、Ziptip C₁₈微柱脱盐；

用移液枪吸取样品，使肽段混合物充分吸附在柱子上，吸取CHCA溶液3 μL，在离心管中反复吸打5次式样品和基质充分混，点在MALDI的靶上，自然晾干结晶，所述CHCA溶液的配制方法为：0.3%的氰-4-羟基苯丙烯酸，用70%乙腈/0.1%TFA稀释。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，银染所用的甲醇应为试剂纯。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，ICP-MS的进样方法选择为蛋白点直接消解进样。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，MALDI-TOF-MS的上样基质为氰-4-羟基苯丙烯酸。