[发明专利]鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法

说明书

本发明公开了一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法，采用DMEM对商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗进行倍比稀释后过滤，然后接种单层DF‑1细胞，于5％CO₂、37℃温箱中作用2h后更换为含1％FBS的DMEM培养至第6天；收集部分细胞培养上清液进行禽白血病病毒p27群特异性抗原检测并抽取其cDNA进行ALV‑A、B、J亚群的PCR鉴定；对阳性样品细胞孔用亚群特异性单抗进行IFA检测。本发明具有具有灵敏、准确、可靠等特点，对禽白血病的检测及防控具有重要的意义。

技术领域

本发明属于禽白血病病毒检测领域，尤其涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法。

背景技术

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的鸡的各种可传播的良性和恶性肿瘤病以及免疫抑制性疾病。ALV属于反转录病毒科、α反转录病毒属，分为A-K 11个不同亚群，其中6个外源性(A、B、C、D、J、K)和1 个内源性(E)共7个亚群可自然感染鸡，其中较常见的为A、B、J亚群，K亚群为近年来从东南亚地区固有地方品种鸡中发现的新亚群。被外源性ALV感染的鸡群除诱发死亡外，临床上多以免疫抑制、生长抑制和各器官组织出现肿瘤等为主要特征，对养禽产业造成了严重的损失。

ALV的感染既可以通过垂直传播也可以通过水平传播。除此之外，相关文献报道接种了被外源性ALV污染的疫苗，不仅感染的鸡群有可能发生相应的肿瘤或对生产性能有不良影响，更严重的是会造成一些带毒鸡将ALV垂直传播给后代，从而会在下一代雏鸡中诱发更高的感染率和发病率。尽管目前部分大型种禽公司开展了对ALV的净化工作并取得成效，但临床生产中仍时有禽白血病的发生，而且表现各异，因此活疫苗中外源性禽白血病病毒的检测对于禽白血病的净化和防控具有极其重要的意义。

市售商品化活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法主要是采用直接PCR的方法，但是直接PCR检测可能出现扩增出的目的片段是基因片段而不是完整的活病毒或者出现假阳性的情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种有效、准确、可靠的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法，采用DMEM对商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗进行倍比稀释后过滤，然后接种单层DF-1细胞，于5％CO₂、37℃温箱中作用2h后更换为含1％FBS的DMEM培养至第6 天；收集部分细胞培养上清液进行禽白血病病毒p27群特异性抗原检测并抽取其cDNA进行ALV-A、B、J亚群的PCR鉴定；对阳性样品细胞孔用亚群特异性单抗进行IFA检测。

上述检测方法，按以下步骤操作进行：

(1)无菌条件下将2mL DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)加入商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中，对其进行溶解；

(2)将溶解的疫苗使用商品化DMEM进行倍比稀释，稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶ 8、1∶16、1∶32、1∶64，将疫苗的各稀释液用直径为0.22μm的一次性过滤器(JET BIOFIL 公司)过滤去除杂质以及减少部分粒子较大的病毒(ALV、IBV、NDV直径依次为80-145nm、 120nm、100～500nm)后，取100μL接种于长成80％左右的单层DF-1细胞，2h后更换成含1％FBS的DMEM维持培养6天，通过观察细胞的生长状况，筛选出疫苗的最佳稀释比例为1∶8，然后进行A、B、J亚群禽白血病病毒检测；