[发明专利]鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法

权利要求书

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法，其特征在于：采用DMEM对商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗进行倍比稀释后过滤，然后接种单层DF-1细胞，于5％CO₂、37℃温箱中作用2h后更换为含1％FBS的DMEM培养至第6天；收集部分细胞培养上清液进行禽白血病病毒p27群特异性抗原检测并抽取其cDNA进行ALV-A、B、J亚群的PCR鉴定；对阳性样品细胞孔用亚群特异性单抗进行IFA检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于按以下步骤操作进行：

(1)无菌条件下将2mL DMEM加入商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中，对其进行溶解；

(2)将溶解的疫苗使用商品化DMEM进行倍比稀释，稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，将疫苗的各稀释液用直径为0.22μm的一次性过滤器(JET BIOFIL公司)过滤，取100μL接种于长成80％左右的单层DF-1细胞，2h后更换成含1％FBS的DMEM维持培养6天，通过观察细胞的生长状况，筛选出疫苗的最佳稀释比例为1∶8，然后进行A、B、J亚群禽白血病病毒检测；

(3)按1∶8稀释疫苗，疫苗稀释液以24孔板复孔取100μL作用于长满80％的单层DF-1细胞2h，随后换成含1％FBS的DMEM维持培养6天；

(4)收集细胞培养物上清，进行ALV-p27抗原检测；ALV-p27阳性样品收集细胞培养物抽取cDNA，用群特异性引物进行A、B、J亚群禽白血病病毒的PCR鉴定，其对应阳性孔细胞用亚群特异性单抗进行IFA检测；

(5)鉴定结果为ALV阳性样品者则取同一批号另一瓶疫苗按照上述步骤进行复检，以排除其他人为操作等污染的可能性。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述ALV-p27抗原检测所用试剂盒为IDEXX ALV-p27试剂盒。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述稀释液为Gibco生产的DMEM。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述维持培养液为含1％FBS的商品化DMEM。