[发明专利]基于紫外-可见光谱技术的牛乳中大肠杆菌的检测方法

说明书

本发明提供了一种在类似牛乳的复杂背景环境下，能有效解决微生物的检测光谱受到不利因素影响产生特征波长红移及噪声明显等现象，引起光谱特征难以拾取、定量检测结果准确性低等问题。首先对大肠杆菌菌粉进行活化和传代培养，配置待测菌悬液；紫外分光光度计获取不同培养时间的待测菌悬液的紫外‑可见光谱；利用标准正态校正法与S‑G卷积平滑法消除噪声干扰，从苯环共轭结构形成机理的角度来解释光谱特征红移现象，以此确定特征波段范围，采用连续投影算法在特征波段内进行特征波长的拾取，根据微生物“二次生长”的规律对特征波长进行有效的筛选；利用偏最小二乘法建立特征波长与微生物总数的模型关系，对牛乳中大肠杆菌的总数进行定量分析。

技术领域

本发明涉及紫外-可见光谱检测技术，尤其涉及一种针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法。

背景技术

大肠杆菌是牛乳中检出率最高的食源性致病菌，是国际公认的卫生监测指示菌，因此更加敏感的捕获大肠杆菌的特异性，实现其高效快速检测对保障我国乳制品安全具有重要意义。目前，牛乳中大肠杆菌的检测和计数主要依靠常规的细菌学培养法：多管发酵法和平板计数法，但此类方法耗时费力，操作专业性强，且无法满足快速、无损检测的需求。

紫外-可见吸收光谱常用于含有共轭体系的蛋白质等生物大分子的分析和研究，通过共轭结构的光谱特征可以反演出细菌微生物的成分组成、浓度等信息。此技术具有无需添加反应试剂、无损伤、操作简便等优点，已被广泛地应用于微生物定量检测中，目前国内外已经有多位学者利用此技术实现对。但有关牛乳中大肠杆菌的光谱特征及其总数的定量检测研究在国内还属空白。

其主要原因是牛乳所含成分复杂，且牛乳中的蛋白质、脂肪等生物大分子颗粒的粒径分布不均会产生光散射等因素引起的噪声干扰，还会大肠杆菌的检测光谱带来特征光谱红移、特征波长难以拾取、定量检测结果不准确等影响。

发明内容

在下文中给出了本发明的简要概述，以便提供关于本发明的有些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。他并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

鉴于此，本发明提供了一种针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法，以解决现有的由于牛乳成分复杂以及牛乳中蛋白质、脂肪等生物大分子产生光散射等因素引起的检测结果不准确的问题。

本发明提供了一种用于基于紫外-可见光谱技术的针对牛乳中大肠杆菌总数的检测方法，整体实验流程包括：将大肠杆菌菌粉进行活化与传代培养，获得具有生长活性的第三代大肠杆菌菌株；在无菌环境下将菌株移种到无菌全脂鲜牛乳中，分装后分别连续培养；将培养好的带菌牛乳放入比色皿中，利用紫外分光光度计获取其200~400nm的紫外-可见吸收光谱；与此同时，将12组培养时间的带菌牛乳进行平板计数，作为定标实验，并获取牛乳中大肠杆菌的数量的真实值；将获取的牛乳中大肠杆菌的紫外-可见吸收光谱导入数据处理软件进行合理的光谱数据处理，并利用紫外-可见吸收光谱对有机化合物中的共轭结构具有更高的敏感性的特点，从苯环共轭结构形成机理的角度来解释光谱特征波段红移现象，以此确定特征波段范围，建立回归预测模型，通过带菌牛乳的吸光度值与总数真实值相关性r与均方根误差值RMSE来评价预测模型的稳定性和预测能力。

进一步地，所述大肠杆菌菌粉活化与传代培养步骤包括：菌种的活化：依据菌种活化说明，在无菌环境下，取适量菌粉于复溶液中，混合均匀后，将菌液划线接种入LB固体培养基中，倒置于37℃恒温培养箱中培养18h；菌体的分离：去除活化后的培养皿；挑取单个菌落于LB营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养18h；菌体的纯化：将得到的菌液进行离心-去离子水洗涤-吸弃上层清液-离心等重复以上步骤三次，为确保菌体不因高速旋转而受到破坏，离心机的速度设置为为3000r/min，并设定时间5min，以上得到大肠杆菌菌悬液。