[发明专利]基于紫外-可见光谱技术的牛乳中大肠杆菌的检测方法

权利要求书

1.用于牛乳中大肠杆菌总数的紫外-可见光谱检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

对微生物菌粉进行活化和传代培养，与纯牛乳混合配置待测菌悬液，在规定时间内连续培养；

利用紫外分光光度计获取不同培养时间的待测菌悬液的紫外-可见光谱；

利用标准正态变量校正法（SNV）结合S-G卷积平滑法消除或减弱噪声干扰；

从苯环共轭结构形成机理的角度来解释光谱特征波段红移现象，以此确定特征波段范围；

采用连续投影算法（SPA）在特征波段内进行特征波长的拾取，根据微生物“二次生长”的生长规律对特征波长进行更加有效的筛选；

利用偏最小二乘法（PLS）建立特征波长与微生物总数之间的模型关系，实现对复杂背景环境下微生物的总数进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测微生物以及复杂背景环境，并对微生物菌粉进行活化和传代培养，配置待测菌悬液的步骤包括：

菌种的活化：依据菌种活化说明，在无菌环境下，取适量菌粉于复溶液中，混合均匀后，将菌液划线接种入LB固体培养基中，倒置于37℃恒温培养箱中培养18h；菌体的分离：去除活化后的培养皿；挑取单个菌落于LB营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养18h；菌体的纯化：将得到的菌液进行离心-去离子水洗涤-吸弃上层清液-离心等重复以上步骤三次，为确保菌体不因高速旋转而受到破坏，离心机的速度设置为为3000r/min，并设定时间5min，以上得到大肠杆菌菌悬液。

3.根据权利要求1或2所述的牛乳中大肠杆菌的紫外-可见光谱的获取步骤包括：

采用紫外分光光度计进行光谱数据的获取，依照牛乳成分的先验光谱信息，将光谱检测范围选定为200~400nm，同时为了避免遗漏有价值的特征信息，采样间隔设置为0.5nm，以去离子水作为参比：从培养好的带菌牛乳中移取5mL于比色皿中，每个时间点的样品重复测量三次，并取其均值作为测量结果；

本文进行了4次独立完整的实验，共获取原始光谱数据144组，经过取均值及对有效光谱的初步筛选，得到可用于进一步预处理的光谱数据共36组，每组数据包含201个波长吸光度值。

4.根据权利要求3所述的光谱数据预处理方法，其特征在于，所述由于引起光谱特征难以提取的主要原因是牛乳中复杂的成分，以及脂肪、蛋白质等生物大分子粒径分布不均引起的光散射现象，因此选择能够有效地校正带菌牛乳光谱的散射现象的标准正态变量校正法（SNV），消除或减弱光谱中的噪声干扰；并进一步使用S-G平滑卷积法消除基线漂移、倾斜等噪声，从而提高模型的稳健性和预测能力。

5.根据权利要求4所述的特征光谱波段选择方法，其特征在于，所述牛乳中大肠杆菌的紫外-可见吸收光谱在300~400nm波段连续出现特征波峰，波峰强度随时间增大且特征波段红移，根本原因是大肠杆菌含有的三种氨基酸分子中均存在苯环共轭结构，且氨基酸分子中苯环取代基存在-COOH与-NH₂不同类对位取代、取代基内部结构复杂以及存在具有亲电取代活性的-OH、-NH₂等取代基团通过共轭结构传递电子效应引起共轭双键数目增加等情况共同作用，促使共轭效应强度增大，特征波峰强度增大、吸收带红移，因此选择300~400nm波段作为光谱的特征波段。

6.根据权利要求5所述的特征光谱波段选择方法，其特征在于，所述针对300~400nm的紫外-可见光谱数据信息采用连续投影法（SPA）进行进一步的特征波长的拾取，拾取得到的特征波长的吸光度值，随时间吸光度的变化曲线均符合细菌的生长曲线，且在3h处均出现了“二次生长”这一规律性变化也完全符合细菌特有的生长规律，表明了SPA算法所提取的特征波长是可以用来表征大肠杆菌生长特点的，进一步证明了SNV-SG-SPA对光谱预处理以及特征波长拾取的准确性。

7.根据权利要求6所述的回归预测模型构建方法，其特征在于，所述利用偏最小二乘法（PLS）建立特征波长与微生物总数之间的模型关系，实现对复杂背景环境下微生物的总数进行定量分析。