[发明专利]一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法

说明书

本发明涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法。基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建的载体包含Cas9、sgRNA、同源臂、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点。经检测，使用本发明制得的重组菌株可大幅提高二元酸的产量，为工业化生产二元酸奠定了基础，同时也为其他酵母、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌等微生物基因的无痕编辑提供了应用借鉴。

技术领域

本发明涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

长链二元酸(Long-chain dicarboxylic acid，DCA)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，包括不饱和二元酸。它们是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料，同时也可作为生产不10-HDA、羟基脂肪酸、不饱和二元酸等脂肪酸衍生物的原料。

目前长链二元酸的生产主要依赖微生物发酵法获取。微生物发酵法主要依赖于微生物特有的氧化能力及其胞内酶的作用，通过增强α及ω氧化的方法，阻断二元酸分解途径，在常温常压下将油脂或者烷烃或者一元羧酸等为生产原料转化为二元羧酸的技术。最初长链二元酸生产技术自20世纪60年代兴起，随后日本、美国和德国等国家开始由相关技术的基础理论研究转入应用开发研究，主要涉及十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)和十六碳二元酸(DC16)的生产。目前国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。

现阶段增加长链二元酸产量的方法是利用同源重组的原理进行减少或增加目的基因的拷贝数，从而增加二元酸的产量，如中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN106754979A(申请号201611218540.2)通过增加长链二元酸转运基因fatlp的拷贝数或者更换启动子增加fatlp基因的过表达。但由于微生物发酵法生产长链二元酸的主要菌种热带假丝酵母为二倍体，利用这种传统基因编辑的方法，不但效率不高，并且转化率与理论转化率相比依然还有较大的提升空间。

酵母作为一种微生物工程菌，在生产脂肪酸等方面一直以来受到很大关注，相比较大肠杆菌，酵母中有蛋白质加工等相关系统，表达的蛋白等产物往往接近天然产物，生物活性好。热带假丝酵母作为一种非常规酵母，具有很高的合成、修饰和储存细胞内脂质的能力，具备较高的脂肪酸衍生物，如：二元酸、ω-羟基脂肪酸、10-羟基-2-癸烯酸、氨基脂肪酸等生产能力或生产潜力，但一直缺乏一种高效无痕的编辑系统对其进行基因编辑，本发明提供一种适用于热带假丝酵母的高效无痕的基因组编辑系统，这无疑具有巨大的应用前景。