[发明专利]一种植株突变体的制备方法

说明书

本申请公开了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。本发明植株突变体的制备方法方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。

技术领域

本发明涉及分子生物血植物不育突变体创制技术领域，特别涉及一种植株突变体的制备方法。

背景技术

雄性不育性是与作物杂种优势利用密切相关的重要性状。水稻是利用杂种优势最为成功的作物之一，也是迄今发现雄性不育多样性最为丰富的作物之一。雄性不育系成为杂种优势利用的最有效武器，其中三系”法是我国推广杂交水稻最早，也是最普遍的一种育种和制种方法，“三系法”主要是利用了核质互作雄性不育系统，完成了“恢复系”、“保持系”和“繁殖系”的三系配套。

其中的不育是由细胞质的遗传物质和细胞核的遗传物质共同决定。而光温敏雄性不育系材料为基础的“两系法”，虽然它打破了恢保关系的限制，极大的提高了配组自由度，繁殖和配组程序也极大的简化，但育性的转换收环境温度和光照的影响，制种风险较大，这也是两系杂交育种无法大面积推广的原因。

自1966年袁隆平先生报道隐性核不育水稻后，相继发现了许多不育材料。这类不育材料的共同特点是不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。针对这一问题，科学家们一直在研究利用分子设计方法，解决不育系繁殖的难题，也先后提出了一些解决方案。

针对解决隐性核雄性不育材料的繁殖问题，1993年6月11日，PLANT GENETICSYSTEM公司(Albertsen)提出了一项PCT专利申请，该专利提出了一种技术思想：在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因以及用于筛选的标记基因，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。

2002年，Perez-Prat等人提出，除了利用上述三套元件的思想可以实现不育系创制和繁殖以外，还可以通过在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因和用于筛选的标记基因两套元件，由此也可以获得该雄性不育植株的保持系，并进一步繁殖不育系(Perez-Prat，2002)。

这些报道提出了利用分子生物学技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的繁殖问题，为开展分子设计杂交育种提供了新的思想。

以上分子设计育种的新思想基于的是水稻细胞核上一对控制育性的基因。当此基因发生突变后，成为无功能的基因后，水稻花粉发育形成的过程受阻，从而产生无活性或不产生花粉，最终表现为不育。因此，突变体的获取是后续基因改造的基础，如何获取育性基因突变的突变体成为制约此项工作的关键点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种植株突变体的制备方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：

T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；

T2.农杆菌转化；

T3.基因敲除检测；

T4.转基因植株表型鉴定。

所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：