[发明专利]一种植株突变体的制备方法

权利要求书

1.一种植株突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；

T2.农杆菌转化；

T3.基因敲除检测；

T4.转基因植株表型鉴定。

2.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：

5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’

5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。

3.一种敲除基因中使用的sgRNA序列，其特征在于，其序列结构如下：

5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’

5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。

4.一种如权利要求3所述敲除基因中使用的sgRNA序列，在构建基因敲除载体中的应用。

5.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2中用到的培养基包括：

筛选培养基：NB；2，4-D 1.8-2.0mg/mL；6-BA 0.1-0.2mg/mL；Hyg 20-25mg/L，Timentin200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；

分化培养基：NB；Pro 0.3-0.5g/L；CH 0.2-0.3g/L；6-BA 1.8-2.0mg/mL；KT 0.8-1.0mg/mL；NAA 0.3-0.5mg/mL，IAA 0.4-0.5mg/mL；Hyg 20-25mg/L；Timentin 200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；

生根培养基：NB；NAA 0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L。

6.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：

含有CYP78A13基因敲除载体质粒的农杆菌在28℃固体YEB培养基上暗培养2天后，用适量100μM/L乙酰丁香酮的培养基将农杆菌洗脱；

调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液；

取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃中暗培养3天。

7.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：

3天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体

用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干；

第二天转移至选择培养基筛选抗性愈伤。

8.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：

每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，18-24天可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出；

抗性愈伤继续继代于附加潮霉素50mg/l的选择培养基中，观察其色泽，一周后将颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，无光泽，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。

9.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：

待抗性愈伤在筛选培养基上筛选3-5d后，挑选部分转移至分化培养基上；

二周后抗性愈伤出现绿芽，3周后长出幼芽，随后根也长出；

将幼苗移至生根培养基上；

待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至大田栽种。

10.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T4.转基因植株表型鉴定，进一步包括：花粉活力检测：转基因阳性植株花粉活性丧失；从株型上看，转基因植株呈现植株营养生长延长，抽穗慢或抽穗不彻底。