[发明专利]Baeyer-Villiger单加氧酶、突变体及其在制备中长链二元羧酸中的应用

说明书

本发明公开了一种来源于铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的Baeyer‑Villiger单加氧酶PaBVMO及其突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组载体和重组表达转化体，以及利用所述重组Baeyer‑Villiger单加氧酶催化长链酮酸或长链酮酯氧化生成酯酸或二酯，再经过简单的化学法水解生成中长链α,ω‑二元羧酸和中链脂肪醇的方法。与现有技术相比，本发明所述的Baeyer‑Villiger单加氧酶具有高区域选择性，催化长链酮酸或长链酮酯氧化，优先生成非常规酯酸或二酯，化学法水解之后直接获得中长链α,ω‑二元羧酸，产物得率高，具有很好的潜在工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的Baeyer-Villiger单加氧酶及其突变体、含有该单加氧酶基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组Baeyer-Villiger单加氧酶催化长链酮酸或长链酮酯的Baeyer-Villiger氧化反应，生成长链酯酸或二酯，进而制备α,ω-二元羧酸的方法。

背景技术

α,ω-二元羧酸因其官能团的特殊性，可以作为单体合成高聚物，如聚酯类、聚酰胺类等各种功能塑料，也可用来合成润滑剂、增塑剂、涂料、高级香料、缓蚀剂等各类精细化学品。化学法合成中长链二元羧酸需要以短链二元羧酸为底物，经过多步反应延伸碳链制得，存在着操作繁琐、得率低等问题，而且化学法合成的都是饱和二元羧酸，链长有限，碳原子数一般不超过13，不饱和长链二元羧酸的化学法合成还未取得突破。相较于化学方法，生物酶法转化合成α,ω-二元羧酸具有专一性好、选择性高、催化反应条件(温度、pH等)温和、能耗低、污染小等特点，受到人们的青睐。尤其是以种类繁多、来源丰富的植物油为底物经生物转化生成α,ω-二元羧酸，符合可持续发展理念，具有广阔的发展前景。

在目前的研究中，由生物法制备α,ω-二元羧酸主要包括两条路径：一条途径是将热带假丝酵母中的脂肪酸β-氧化途径切断，利用P450酶系催化脂肪酸的ω-氧化从而合成二元羧酸；另一条途径需要水合酶、醇脱氢酶、Baeyer-Villiger单加氧酶等多酶级联催化，将不饱和脂肪酸转化生成酯酸，进一步水解生成二元羧酸。在后一条路径中，Baeyer-Villiger单加氧酶(缩写为BVMO)催化酮酸化合物的不对称Baeyer-Villiger氧化生成相应的酯酸，是该途径中的关键酶。

根据催化底物的特异性，可以将BVMO分为环己酮单加氧酶(CHMO)、环戊酮单加氧酶(CPMO)、4-羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO)和直链脂肪酮单加氧酶(AKMO)等不同类别。其中，直链脂肪酮单加氧酶也可以催化酮酸化合物的氧化，但目前对于这类酶的报道较少。Kirschner等对来自荧光假单胞菌的PfBVMO进行了克隆表达，该酶对碳原子数为8-12的脂肪酮活性较高(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,73:1065-1072)。Rehdorf等克隆得到来自恶臭假单胞菌的PpBVMO，该酶对芳香酮、环酮、脂肪酮(3-癸酮、2-十一酮、2-十二酮等)都有较高的活性(Biotechnol.Lett.,2007,29:1393-1398)。Altenbuchner等克隆了来自铜绿假单胞菌的单加氧酶MEK700，该酶的底物谱较广，对直链酮、芳香酮和环酮类化合物都有活性(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,77:1251-1260)。Bisagni等克隆得到迪茨氏菌属中的BVMO，该酶偏好的催化底物是直链脂肪酮，包括2-壬酮、2-庚酮、3-癸酮等(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2014,109:161-169)。