[发明专利]一种霍山石斛精制多糖抗肿瘤活性的检测方法

权利要求书

1.一种霍山石斛精制多糖抗肿瘤活性的检测方法，其特征在于：该检测方法包括体外抗肿瘤检测方法和体内抗肿瘤活性检测方法，其中，

(1)体外抗肿瘤检测方法步骤为：

①把肿瘤细胞接种到新鲜培养基中进行培养，培养至对数生长期，并制成细胞悬液，接种到细胞培养板上；

②配置不同浓度的霍山石斛精制多糖，肿瘤细胞贴壁生长后，弃去旧培养基，设置对照组，在每组加入不同浓度的霍山石斛精制多糖，分别在培养箱内培养12h、24h、48h和72h；

③取出细胞培养板，加入MTT溶液，遮光孵育；

④取出细胞培养板，吸出上清液，加入DMSO终止反应，在避光条件下放置在摇床上震动；

⑤用酶标仪测定其OD值，每次重复测量3次；

(2)体内抗肿瘤活性检测的方法步骤为：

①实验动物喂养及LLC肺癌移植瘤模型建立，选择C57BL/6J雄性小鼠，6周龄，在SPF级动物实验室喂养，每天维持光照和黑暗环境，小鼠可以自由的摄取水和食物，适应性喂养一周后，设正常组小鼠，剩余小鼠接种LLC肺癌细胞，抽取LLC细胞悬液接种于消毒后的C57BL/6J小鼠右腋下，并压迫注射点，继续在SPF级条件下饲养；

②实验分组及给药干预，建模后继续饲养小鼠，除正常组外，排除瘤块过大或过小者，将符合标准的荷瘤小鼠随机分为5组，分别为模型组、阳性组、霍山石斛茎精制多糖高剂量组、霍山石斛茎精制多糖中剂量组以及霍山石斛茎精制多糖低剂量组，开始灌胃给药，给药组采用中国药典人正常摄取推荐石斛用量低剂量6g/60kg·d为标准，根据抗肿瘤药物药效学指导原则，每种提取部位给药组设高、中、低三个剂量，按5倍、10倍及20倍给药，溶剂为生理盐水；

③小鼠体内抗肿瘤活性监测指标，一般情况观察：小鼠反应、活动情况、精神状况和毛发变化，每隔三天称取小鼠体重，绘制体重变化曲线；

摄食摄水情况观察，每隔三天对小鼠饮食情况进行记录；

实验结束CO₂窒息处死小鼠，收集小鼠各器官，称重，计算脏器指数，瘤组织解剖，称重，测量肿瘤长短径，根据V＝1/2ab²计算肿瘤体积，拍照。

2.根据权利要求1所述的一种霍山石斛精制多糖抗肿瘤活性的检测方法，其特征在于：具体操作参数如下：

(1)体外抗肿瘤检测方法步骤为：

①取处于对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化离心后调节细胞浓度为2×10⁵个每毫升，接种在96孔细胞培养板上，每孔100μL，96孔板边缘孔用无菌PBS填充，置于含5％CO₂的37℃培养箱中过夜；

②贴壁生长后，弃去旧培养基，对照组加入新鲜培养基100μL，阳性对照组加入含抗肿瘤阳性药物的完全培养基100μL，实验组加入含不同浓度霍山石斛茎精制多糖的完全培养基100μL，设置每组3个复孔，分别在培养箱中培育12h、24h、48h和72h；

③取出细胞培养板，每孔加入10μLMTT溶液，37℃遮光孵育4h；

④取出细胞培养板，吸出上清液，加入150μL DMSO终止反应，在避光条件下放置在摇床上震动10min；

⑤490nm波长下用酶标仪测定其OD值，每次重复测量3次；

(2)体内抗肿瘤活性检测方法的步骤为：

①实验动物喂养及LLC肺癌移植瘤模型建立，C57BL/6J雄性小鼠，6周龄，在SPF级动物实验室喂养，温度25℃,相对湿度50％-60％，每天维持12h光照和12h黑暗环境，小鼠可以自由的摄取水和食物，适应性喂养一周后，设正常组小鼠，12只，剩余小鼠接种LLC肺癌细胞，用1mL微量注射器抽取LLC细胞悬液接种于消毒后的C57BL/6J小鼠右腋下，每只各接种0.2mL，并压迫注射点，继续在SPF级条件下饲养；

②实验分组及给药干预，建模后继续饲养小鼠，除正常组外，10天后瘤块长至100mm³时，排除瘤块过大或过小者，将符合标准的荷瘤小鼠随机分为5组，每组12只，分别为模型组、阳性组、霍山石斛茎精制多糖高剂量组、霍山石斛茎精制多糖中剂量组以及霍山石斛茎精制多糖低剂量组，开始灌胃给药，共灌胃30d，给药组采用中国药典人正常摄取推荐石斛用量低剂量6g/60kg·d为标准，根据抗肿瘤药物药效学指导原则，每种提取部位给药组设高、中、低三个剂量，按5倍、10倍及20倍给药，溶剂为生理盐水；

③小鼠体内抗肿瘤活性监测指标，一般情况观察：小鼠反应，活动情况，精神状况，毛发变化，每隔三天称取小鼠体重，绘制体重变化曲线，摄食摄水情况观察，每隔三天对小鼠饮食情况进行记录；

实验结束CO₂窒息处死小鼠，收集小鼠各器官，称重，计算脏器指数。瘤组织解剖，称重，测量肿瘤长短径，根据V＝1/2ab²计算肿瘤体积，拍照。