[发明专利]一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法

说明书

本发明涉及一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法。利用带标签的选定重组核受体蛋白选择性地吸附到磁珠载体上，再根据核受体与小分子亲和结合的原理，利用重组核受体蛋白特异性地从复杂环境介质中捕获具有结合活性的效应物质，再结合超高效液相色谱‑四级杆静电场轨道阱高分辨质谱技术进行高通量、非靶向效应物质的分析。本发明提高了物质鉴定的特异性和效率，能够应用于环境中与核受体结合的效应物质的快速筛选和结构鉴定，也可以用于药物开发。

技术领域

本发明属于生物化学检测领域，涉及一种筛查与重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质的方法，特别涉及一种重组核受体蛋白固定于镍磁珠上的亲和结合筛选方法及其基础上建立的高通量非靶向效应物质鉴定方法。

背景技术

全球化学品正在以爆炸性的速度增长，迄今为止美国化学文摘社登记了超过1.087亿个商用化学品，这些物质在给人们生活带来便利的同时也以各种形式进入环境介质，如室内灰尘，饮用水等。大量研究表明环境中一些化学物质会干扰内分泌系统，从而影响生态与人类健康，但是对于导致这些问题的特定的效应物质，知之甚少。

鉴定复杂环境介质中有毒的化合物组成主要障碍在于环境基质的复杂性，目前环境中生物效应物质的鉴定主要是利用效应导向的化学物质鉴定方法(Effects directedanalysis,EDA，可参见Brack W.Effect-directed analysis:a promising tool for theidentification of organic toxicants in complex mixtures.Anal BioanalChem.2003.377(3):397-407.)。但是该方法耗时耗力，需要采用气相或液相色谱进行多步馏分分割实验，化学分析和生物活性测试相互独立，特异性差，选择性低，因此复杂环境基质中痕量生物效应物质鉴定的成效非常低下。

发明内容

为了从环境样品中特异性地高通量筛选和鉴定生物效应物质的目的，本发明提供了一种基于核受体蛋白与小分子亲和结合原理的生物效应物质的高通量鉴定方法。

本发明采取的技术方案为：

一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质筛查鉴定方法，包括：

将带标签的选定重组核受体蛋白与待测环境介质混合，使上述重组核受体蛋白结合环境介质中的生物效应物质；

将结合生物效应物质的重组核受体蛋白固定到磁珠载体上；

洗脱得到核受体蛋白与生物效应物质的混合物；

对混合物进行液液萃取得到样品；

采用不表达上述重组核受体蛋白的空载体蛋白，基于上述同样过程得到对照；

筛选样品与对照之间的差异化合物；

通过化学数据库和质谱数据库搜索以鉴定上述差异化合物。

进一步地，本发明通过对样品和对照进行高分辨液相色谱质谱检测，采用Progenesis QI软件对采集到的数据进行设定的预处理，再采用Simca-P软件对预处理后的数据进行多元统计方法分析，筛选出两者之间的差异化合物。

进一步地，上述多元统计方法包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Projections to Latent StructuresDiscriminant Analysis，OPLS-DA)，根据变量重要性因子VIP、非参数T检验、样品组与对照组峰面积倍数关系(fold change)(样品组是重组核受体蛋白结合效应物质和非特异性物质，对照组是空载体蛋白结合非特异性物质)来筛选上述差异化合物。