[发明专利]一种百合种球组织的保存方法

说明书

本发明涉及植物种球组织保存技术领域，尤其是一种百合种球组织的保存方法。经过在预培养过程中，将百合种球组织云母包衣，可以提高百合种球组织的抗逆性和成活率；采用淀粉和抗冻糖蛋白作为外源物质加入至玻璃化溶液中使用，以防止百合种球细胞膜免受损伤，提高了百合种球组织的恢复生长率。

技术领域

本发明涉及植物种球组织保存技术领域，尤其是一种百合种球组织的保存方法。

背景技术

百合是百合科百合属的草本植物，为世界著名的球根花卉，具有花色丰富、姿态优美的特色。百合被广泛运用在园林布景、切花、鲜花和盆栽观赏等方面。中国作为百合分布中心，种质资源丰富，但多数野生种仍属于濒危植物。百合作为多年生球茎草本，不能通过低温种子库进行保存，目前主要的保存方式为田间种植保存，田间保存易在保存过程中出现褐变、腐烂，因此百合的中长期保存问题亟待解决。

超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术，通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，如专利CN201410468249.5公开的一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理百合胚性愈伤组织以提高其保存效果；又如植物遗传资源学报2007.8(2)：170-173公开的“切花百合离体茎尖玻璃化法超低温保存研究”，超低温玻璃化法目前保存的都是离体植物愈伤组织或细胞。

玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，但是不同的植株或细胞或组织其玻璃化溶液及外源物质的选择将直接影响植株的存活率和保存效果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种百合种球组织的保存方法，通过以下技术方案得以实现。

一种百合种球组织的保存方法，包括如下步骤：

1)预培养：将百合种球清洗干净，消毒，切片，裹上一层包衣后，置于冰桶中保存0.5～4小时；

2)脱水：将百合种球组织转移至冷冻管中，室温下用玻璃化溶液处理20～35min，再用PVS2原液在0℃条件下处理10～50min；

3)液氮保存：移去PVS2原液，用蜡块包封百合种球组织，密封在冷冻管内，直接投入液氮中冷冻保存；

4)化冻：取出液氮中封存的百合种球组织，迅速化冻，除去表面石蜡层，用洗涤液洗涤2～3次，进行恢复培养。

步骤(1)所述的包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖的混合物，可使得百合种球形成表面膜层，提高百合种球的保鲜效果和成活率。

进一步，所述的云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖的混合物按10：(5～8)：3混合。

步骤(2)的玻璃化溶液为浓度为60％的PVS2溶液。

进一步，所述的60％的PVS2溶液为0.4mol/L蔗糖液体培养基与PVS2溶液按4：6所得混合液。

进一步，所述的PVS2溶液组成为30％甘油、15％乙二醇、15％DMSO、3％的蔗糖、3％淀粉和0.4mol/L抗冻糖蛋白。

步骤(4)所述的百合化冻方法为将百合种球从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。

进一步，所述水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s。

进一步，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖和5～10mmol/LKNO₃的MS培养液。