[发明专利]一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母

说明书

本发明公开了一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程毕赤酵母及其构建方法。本发明将α‑淀粉酶基因、糖化酶基因和乳酸脱氢酶基因通过毕赤酵母表达载体pTEFZαA整合至毕赤酵母基因组上构建而成。本发明构建的毕赤酵母发酵生产乙醇的能力低，可以减少碳源的流失，减少副产物的生成，增加乳酸的产率。其次，在发酵生产乳酸的过程中，无需另外添加商业化淀粉水解酶，简化了在发酵餐厨废弃物过程中的实际操作步骤，也降低了生产成本，更适用于工业化运用。

技术领域

本发明涉及遗传工程及发酵工程领域，尤其涉及一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母及其构建方法。

背景技术

餐厨废弃物又称泔水、潲水，是居民在生活消费中形成的废弃物，其主要含有动物肉类，蔬菜，油脂，面包，米饭等。在化学成分上，主要含有蛋白质，脂肪，淀粉，纤维素等成分，其营养丰富，极易滋生金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等多种病原微生物，餐厨废弃物腐烂后会发出恶臭，对周围的空气造成污染。据统计，全球每年约有4亿吨餐厨废弃物产生，造成的浪费高达7,500亿美元，而且，随着经济的不断发展，餐厨废弃物的量在每年递增。餐厨废弃物的产生集中在城市的饭店、学校食堂等地方。但是，目前大部分的餐厨废弃物被用来喂猪、填埋，甚至制造“地沟油”，造成了严重的环境污染，仅少部分得以合理利用，比如焚烧、堆肥和沼气等等，但经济效益低下。因此，寻找一种能将餐厨废弃物进行充分资源化利用的办法，是餐厨废弃物处理面临的重要课题。

乳酸在食品，化妆品，药品以及工业上均有广泛的应用，使得乳酸的需求量在逐年上升，从2010年到2016年全球乳酸需求量从480,000吨上升到1,070,000 吨，平均每年上升14.2％。目前乳酸的生产大都是以粮食为原料，成本高，所以降低乳酸的生产成本是非常有必要的。利用餐厨废弃物生产高价值产品乳酸，不仅可以解决餐厨废弃物带来的环境污染问题，还可以变废为宝，具有巨大的社会效益。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇营养性酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源生长。生物量高，是最成功的外源蛋白表达宿主之一。其具有以下几个优点： (1)毕赤酵母属于克雷布特效应阴性菌(Crabtree-negative)，在富含葡萄糖的培养基中生长时，呼吸作用不受抑制，不产生乙醇，在严格好氧的条件下能够快速生长；(2)毕赤酵母属于单细胞生物，易满足于低营养条件，生长速度快，操作简便，高密度培养工艺成熟，已能应用于工业化大规模生产的发酵罐培养，细胞干重达到150g/L；(3)外源基因的表达通常通过基因组整合的方式整合在毕赤酵母基因组上，遗传稳定，连续培养50代外源基因遗传依然稳定；(4)外源蛋白表达量高，且自身分泌蛋白量少；(5)有完善的翻译后修饰系统，能保证外源蛋白表达的活性。

但是毕赤酵母缺乏有效降解淀粉生成葡萄糖，并将葡萄糖转化成乳酸的酶，在自然条件下，毕赤酵母不能直接利用餐厨废弃物中的淀粉用于生产乳酸。因此为了以餐厨废弃物作为原料发酵生产乳酸，必须通过基因工程，将降解淀粉和生产乳酸的基因导入毕赤酵母中，以弥补其降解餐厨废弃物和成产乳酸的缺陷。使重组毕赤酵母可以利用自身合成的淀粉酶将淀粉降解成可利用的碳源，并在乳酸脱氢酶的作用下，打通毕赤酵母乳酸合成途径，最终得到目标产物乳酸。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种基因重组毕赤酵母，将α-淀粉酶基因(α-amylase，Amy)、糖化酶基因(glucoamylase，Ga)和乳酸脱氢酶基因(lactate dehydrogenase，LDH)通过毕赤酵母表达载体(pTEFZαA)整合至毕赤酵母基因组上构建而成。

所述毕赤酵母表达载体pTEFZαA为以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，以毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子(TEF)SEQ ID NO.1替换毕赤酵母表达载体pGAPZαA的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子而得。包括如下步骤：