[发明专利]一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母

权利要求书

1.一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母，其特征是将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和乳酸脱氢酶基因通过毕赤酵母表达载体pTEFZαA整合至毕赤酵母基因组上构建而成；所述α-淀粉酶基因的序列如SEQIDNO.2所示，所述糖化酶基因的序列如SEQ IDNO.3所示，所述乳酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述毕赤酵母表达载体pTEFZαA为以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，以毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子SEQ ID NO.1替换毕赤酵母表达载体pGAPZαA的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子而得。

2.如权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母，其特征在于，包括如下步骤：

（1）通过PCR扩增，获得毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子TEFDNA片段；

（2）使用限制性内切酶BglII和Bsp119I分别对上述DNA片段和载体pGAPZαA进行双酶切，然后将TEF片段连入载体，得到TEF启动子取代了GAP启动子的毕赤酵母表达载体pTEFZαA。

3.权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

S1：利用PCR技术分别扩增α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶基因，并在三个基因序列的5’端和3’端分别加上限制性内切酶Bsp119I和XbaI识别位点；使用限制性内切酶对毕赤酵母表达载体pTEFZαA和pGAPZαA，以及分别连接至载体上的SEQ ID NO.2所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.3所示的糖化酶基因和SEQ ID NO.4所示的乳酸脱氢酶基因进行双酶切，纯化回收所需片段；

S2：使用DNA连接酶将α-淀粉酶基因和糖化酶基因分别连入毕赤酵母表达载体pGAPZαA，将乳酸脱氢酶基因连入毕赤酵母表达载体pTEFZαA，形成三个重组单基因表达载体；

S3：使用限制性内切酶将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒和糖化酶基因表达盒从重组单基因表达载体上切下，然后以串联表达盒的形式逐个接入带有乳酸脱氢酶基因的单基因表达载体中，构建出α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶三基因共表达载体；

S4：使用限制性内切酶对上述构建的三基因共表达载体进行单酶切，使其线性化后将其转入毕赤酵母，并整合到其基因组上，获得能降解利用餐厨废弃物的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母。

4.如权利要求3所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述三基因共表达载体的构建包括如下步骤：

S11：使用限制性内切酶对α-淀粉酶和糖化酶重组单基因表达载体进行双酶切，回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表达盒；

S12：使用限制性内切酶对乳酸脱氢酶重组单基因表达载体进行酶切，然后将糖化酶基因表达盒连入乳酸脱氢酶单基因表达载体，构建糖化酶和乳酸脱氢酶二基因表达载体；

S13：使用限制性内切酶对步骤S12所构建的二基因表达载体进行酶切，然后将α-淀粉酶基因表达盒连入二基因表达载体，构建出α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶三基因共表达载体。

5.如权利要求3所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述的限制性内切酶为Bsp119I和XbaI；步骤S4中所述的限制性内切酶为ScaI。

6.如权利要求4所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤S11中所述的限制性内切酶为BglII和BamHI；步骤S12中所述限制性内切酶为BglII；步骤S13中所述限制性内切酶为BglII。