[发明专利]一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用。所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。利用本发明所述打靶载体对猪GHR基因进行靶向敲除，敲除效率可达到12.7％，将GHR基因敲除成功的体细胞通过体细胞核移植技术还可进一步构建GHR基因敲除猪模型，为研究GHR基因的生理作用和分子机制提供材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及敲除GHR基因的猪细胞系的制备方法。

背景技术

莱伦氏综合征(Laron syndrome)是一种生长激素受体(Growthhormonereceptor,GHR)突变造成的罕见常染色体隐性遗传病。这一突变造成生长激素通过GHR的信号转导出现障碍，进而影响胰岛素样生长因子1(Insulin like growth factor 1,IGF1)的产生，最终影响生长激素对机体的促生长、代谢、发育作用。该病主要病症是(1)侏儒；(2)体内低水平的生长激素，高水平的IGF1。目前临床上主要通过给患者补充IGF1来治疗该疾病，但长期补充IGF1不可避免的会产生一系列的副作用，例如肥胖、低血糖、头痛、颅内高血压、淋巴结肿胀和雄激素增多等。随着研究人员对该病的研究，发现罹患该病的患者具有极低几率患癌症的特点，多发展为脂肪肝，并且以GHR缺陷的小鼠为研究对象，发现GHR缺陷可能与肥胖、低血脂症、心血管等疾病相关。

为了研究莱伦氏综合征的致病机理及筛选治疗药物，人们建立大量的小鼠模型，用于研究GHR在繁殖、生长、糖脂代谢、寿命和肥胖等方面的作用。但由于小鼠与人存在的差异，在研究骨骼生长和脂肪代谢方面与人类差别巨大。而猪与人具有相似的大小和生理状态，猪的器官发育及疾病进展也与人类似，并且猪的基因组序列及染色体结构与人具有高度同源性，更有利于疾病机理的探究。

因此，急需提供一种可高效构建GHR敲除猪疾病模型的方法，为莱伦氏综合征的治疗提供良好的研究基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用，所述打靶载体可实现对猪GHR基因的高效敲除。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。

作为优选，所述靶标序列符合5′-N(20)NGG-3′的排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G中的任意一个碱基。

所述sgRNA表达载体是将sgRNA的靶标序列的5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的初始载体相连接。

优选所述初始载体为本领域常用的pX330。

进一步优选，靶标序列位于猪GHR基因第10外显子的sgRNA序列如下：

U1-F：caccgTCATATAGTACAGTCTCCAC；

U1-R：aaacGTGGAGACTGTACTATATGAc；

靶标序列位于猪GHR基因3′UTR区sgRNA序列如下：

D3-F：caccgAATAGGGCTAGGAAGGAGGC；

D3-R：aaacGCCTCCTTCCTAGCCCTATTc。

本发明还进一步提供了所述打靶载体在制备猪GHR基因敲除细胞或GHR基因敲除猪方面的应用。