[发明专利]一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用

权利要求书

1.一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。

2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述靶标序列符合5′-N(20)NGG-3′的排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G中的任意一个碱基。

3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述sgRNA表达载体是将sgRNA的靶标序列的5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的初始载体相连接。

4.根据权利要求3所述的打靶载体，其特征在于，所述初始载体为pX330。

5.根据权利要求1～4任一项所述的打靶载体，其特征在于，靶标序列位于猪GHR基因第10外显子的sgRNA序列如下：

U1-F：caccgTCATATAGTACAGTCTCCAC；

U1-R：aaacGTGGAGACTGTACTATATGAc；

靶标序列位于猪GHR基因3′UTR区sgRNA序列如下：

D3-F：caccgAATAGGGCTAGGAAGGAGGC；

D3-R：aaacGCCTCCTTCCTAGCCCTATTc。

6.权利要求1～5任一项所述的打靶载体在制备猪GHR基因敲除细胞或GHR基因敲除猪方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞，或进一步将获得的GHR基因敲除的细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述体细胞系为成纤维细胞系或肾细胞系。

9.一种制备猪GHR基因敲除细胞的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述的打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞。

10.一种制备GHR基因敲除猪的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述的打靶载体转染猪成纤维细胞系，筛选获得GHR基因敲除的成纤维细胞，并将所获得的GHR基因敲除的成纤维细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。