[发明专利]限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用

说明书

本发明提供了一种限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)使带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到表面吸附有聚合物微球的多孔材料；(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；(3)在不破坏多孔材料孔道内功能基团的前提下，除去多孔材料表面吸附的聚合物微球；(4)对步骤(3)得到的多孔材料外表面进行化学修饰，使外表面具有亲水性，得到所述限进型色谱填料。本发明提供的限进型色谱填料对蛋白具有很高的排阻率，而且对于小分子物质显示出较强的保留能力和分离能力。

技术领域

本发明属于色谱分离材料的技术领域，涉及一种限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用。

背景技术

生物和环境样品基体复杂以及被测物浓度低，决定了在测定前必须对其进行合适的前处理。固相萃取由于具有较短的萃取时间、较高的回收率、较高的富集因子、较少的试剂消耗、易于实现自动化及无相分离操作等优点，目前已经成为最为常用的生物体液及环境水样的样品前处理方法。当用固相萃取分离富集生物组织样品中的小分子分析物时，经常碰到的一个问题就是样品中的生物大分子如蛋白质及核酸等，遇到疏水性反相固相萃取填料时发生生物大分子的变性，变性后的大分子物质会吸附在填料的表面，造成填料孔径堵塞、分析物在固定相上的传质效率下降等不利现象，从而使柱效降低、吸附容量下降、萃取柱寿命缩短，最终造成对小分子分析物测定的严重干扰。

限进介质固相萃取吸附剂在一定程度上克服了上述不足，这类吸附剂同时兼具针对大分子的体积排阻功能和针对小分子分析物的萃取功能，通过控制吸附剂合适的孔径和对吸附剂外表面进行适当的亲水性修饰，使得生物或环境样品溶液中的大分子不能进入吸附剂的内孔中去，且亲水性的外表面保证了生物大分子在吸附剂的外表面不会发生不可逆的变性和吸附，这些措施保证了在上样过柱时，该类吸附剂不会对大分子产生保留，大分子物质在死体积或近于死体积的情况下被洗脱除去，而该类吸附剂的内孔表面则仍为反相萃取剂或离子交换萃取剂性质，这种结构上的特点就可保证在生物大分子或腐植酸的存在下，实现对小分子分析物的萃取。

近年来，限进填料已有文献报道(Anal.Bioanal.Chem.，2006，384：1462-1469；J.Chromatogr.B，2004，801：141-156)，但文献中提供的方法在合成中要通过酶解的方式在硅胶外表面引入亲水基团，导致成本较高。CN102335597A提供了一种限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料及制备方法，其在硅胶表面包覆聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)，然后在包覆层表面接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，在经过水解得到亲水性表面，得到的色谱填料应用范围较窄，可对生物复杂样品中的疏水性化合物进行有效分离。CN103626934A公开了一种限进型聚(甲基丙烯酸-3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料，其在硅胶表面接枝双层聚合物，内层为聚(甲基丙烯酸-3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，其色谱填料可用作生物样品及环境样品分子的色谱固定相，进行阳离子型化合物的直接进样提取，应用范围较窄。制备限进介质型色谱填料时，也常采用物理屏蔽的方式，利用介质中的孔道结构尺寸对生物大分子进行排阻，这种类型的限进型色谱填料一般要求孔径小于8nm，使用这种物理屏蔽的方式大大限制了其应用范围。

目前需要开发一种新型的限进型色谱填料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种限进型色谱填料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)使带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到表面吸附有聚合物微球的多孔材料；

(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；