[发明专利]一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法

说明书

本发明提供一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法，利用一定浓度的崩溃酶在适宜的温度下使菌丝与卵孢子分离，再通过多次低速离心的方法去除多余菌丝和孢囊孢子等，最后再将卵孢子悬浮液涂板于水琼脂上，在光学显微镜下观察并利用刀片进行分离单个卵孢子。该方法也适用于卵孢子产生较少的菌株，而且成功率较高，大大节省了操作时间，同时操作难度也大大降低，是病原群体研究试验中快速、大批量分离单个卵孢子的一种行之有效的方法。该方法成功地用于马铃薯晚疫病菌群体遗传试验研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法。

背景技术

马铃薯晚疫病（Potato Late Blight）由致病疫霉引起，导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性卵菌病害。世界各地马铃薯产区都有发生，流行年一般减产30%。19世纪40年代爱尔兰马铃薯大量死亡，减产一半，使 100多万人饿死，200万人移居海外。当时对马铃薯死亡的原因有各种推测，1842年冯·马蒂尤斯（vonMartius）首先认为是病菌引起，1857年斯皮尔许奈德（Speerschneider）证明叶上霉菌能引起块茎腐烂。1861～1863年德巴利（deBary）确定了叶上病斑和块茎腐烂都是由一种真菌引起并给鉴定了病原菌。在中国马铃薯产地都有发生，西南地区较为严重，东北、华北与西北多雨潮湿的年份为害较重，如1950年大流行年，这些地区损失30%～50%。以后的10年内又有5年是流行年。近年来也有马铃薯晚疫病菌的自育型菌株出现的报道，并且在部分地区成为主要交配型。卵孢子具有厚壁，可以在土壤中生存长达2-4年，成为来年的初侵染源。通过有性繁殖进行基因重组，形成新的致病力更强的菌株，有性繁殖可能是造成马铃薯晚疫病菌群体结构向复杂性、高致病力发展的主要原因。因此提高分离大量马铃薯晚疫病菌菌株的单个卵孢子的效率有利于探讨有性生殖对群体遗传结构的影响具有重要意义。

实验室中通过单菌丝分离法获取晚疫病菌的成功率较低，一般在30-50%左右。主要原因是病斑中和疫霉病菌混生的镰刀菌，丝核菌，腐霉菌等杂菌的生长速度较快，在分离纯化过程中会先晚疫病菌长出，抑制马铃薯晚疫病菌的生长或其菌丝将晚疫病菌覆盖从而得不到纯菌株。常规制备卵孢子悬浮液的方法是对培养一定程度的菌丝和培养基一起高速匀浆，然后通过不同孔径的筛网进行过滤而制备的，该方法对于生产卵孢子较少的菌株不适用，而且快速制备大量样本的卵孢子悬浮液需要大量的筛网以保证无菌操作，操作难度大、耗时久、成功率低，操作期间又极易增加污染的几率分离效率较低。因此都很难在短时间内为群体遗传研究提供大量晚疫病菌菌株的DNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法，解决了现行马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）研究中单个卵孢子分离方法操作难度大、耗时久、成功率低的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）活化马铃薯晚疫病菌菌株，将菌株接入在黑麦培养基中，置于19℃黑暗条件下培养至15-18天收集菌丝；

（2）称取80-100mg菌丝于1.5mL的离心管中，加入 1mL的无菌水置于4℃冰箱中低温处理2-3h，刺激孢子囊释放游动孢子；

（3）然后1000r/min，离心2min，去除上清液，加入浓度为30mg/mL的崩溃酶解菌丝、孢子囊和游动孢子，其中崩溃酶是用pH=7.0的PBS缓冲液配置的，并用0.22μm的细菌过滤器过滤；

（4）离心1000r/min，1min，去除上清液，加入1mL无菌蒸馏水；依次经过孔径为76μm、40μm 和20μm 的尼龙网过滤，用无菌水冲洗20μm的尼龙网于小烧杯中，收集卵抱子悬浮液；

（5）用血球计数板调整卵孢子悬浮液浓度，将卵孢子悬浮液浓度调整到500 个/ mL；