[发明专利]一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法在审
| 申请号： | 201810763102.7 | 申请日： | 2018-07-12 |
| 公开（公告）号： | CN108865966A | 公开（公告）日： | 2018-11-23 |
| 发明（设计）人： | 沈林林;詹家绥;祝雯;周世豪;蔡铭铭 | 申请（专利权）人： | 福建农林大学 |
| 主分类号： | C12N3/00 | 分类号： | C12N3/00;C12R1/645 |
| 代理公司： | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人： | 蔡学俊 |
| 地址： | 350002 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 分离马铃薯 菌丝 晚疫病菌 马铃薯晚疫病菌 光学显微镜 病原群体 低速离心 群体遗传 试验研究 悬浮液涂 研究试验 孢囊孢子 崩溃酶 水琼脂 刀片 菌株 去除 成功率 观察 成功 | ||
【权利要求书】：
1.一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）活化马铃薯晚疫病菌菌株，将菌株接入在黑麦培养基中，置于19℃黑暗条件下培养至15-18天收集菌丝；
（2）称取80-100mg菌丝于1.5mL的离心管中，加入 1mL的无菌水置于4℃冰箱中低温处理2-3h，刺激孢子囊释放游动孢子；
（3）然后1000r/min，离心2min，去除上清液，加入浓度为30mg/mL的崩溃酶解菌丝、孢子囊和游动孢子，其中崩溃酶是用pH=7.0的PBS缓冲液配置的，并用0.22μm的细菌过滤器过滤；
（4）离心1000r/min，1min，去除上清液，加入1mL无菌蒸馏水；依次经过孔径为76μm、40μm 和20μm 的尼龙网过滤，用无菌水冲洗20μm的尼龙网于小烧杯中，收集卵抱子悬浮液；
（5）用血球计数板调整卵孢子悬浮液浓度，将卵孢子悬浮液浓度调整到500 个/mL；
（6）取1mL卵孢子悬浮液，离心1000r/min，1min，去除750μL上清液，加入1mL无菌蒸馏水，重复步骤3次；
（7）将50-100μL孢子囊悬浮液涂板于水琼脂上，于10×10倍显微镜下镜检，若观测到单个卵孢子，则利用无菌刀片进行分离单个卵孢子，并将含单个卵孢子的水琼脂块移置2mL的离心管中。
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