[发明专利]一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒

说明书

本发明提供的转移载体pLSEG‑EG95的TK基因同源臂之间插入了EG95和两个筛选标记基因。所述的EG95基因开放阅读框(ORF)上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号。所述的转移载体使用了筛选标记eGFP基因，使得后期筛选更为便捷；又由于引入了gpt基因，较大程度降低了亲本病毒的污染，使重组病毒的纯化更为容易。

技术领域

本发明属于重组病毒疫苗技术领域，具体涉及一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒。

背景技术

细粒棘球蚴病，俗称“包虫病”，是一种人兽共患病，严重危害绵羊、山羊、人等宿主的健康，已经引起了各国对这一公共卫生问题的关注。该病是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的幼虫，细粒棘球蚴引发的一种慢性地方性寄生虫病。细粒棘球绦虫属于扁形动物门、绦虫纲、圆叶目、带科、棘球属。其生活史包括虫卵、六钩蚴、棘球蚴和成虫四个阶段，终末宿主是犬、狼等犬科食肉动物，中间宿主主要是羊、牛等偶蹄兽，人因误食被虫卵污染的水和食物而成为中间宿主。在我国，细粒棘球蚴病主要流行于西部和西北部诸省区，严重阻碍了农牧区经济发展。

绵羊和山羊是该病最主要的中间宿主，其疫苗防疫目前只依赖于EG95蛋白基因工程亚单位疫苗。该蛋白包含156个氨基酸，分子量约为17kD。免疫组化证明，Eg95蛋白位于六钩蚴、育囊生发层和原头蚴以及成虫体被上，可能在六钩蚴钻穿小肠绒毛上皮层的过程中起重要作用。EG95蛋白的重组亚单位疫苗能诱导较高水平的免疫保护，但免疫保护期相对较短，按实际情况需复免多次。因此，开发基于EG95蛋白免疫期更长的新型疫苗就显得尤为重要。

山羊痘病毒活载体疫苗是山羊痘病毒(goatpox virus,GPV)新型疫苗的研究方向。由于山羊痘病毒基因组较大，复制非必需区较多，且具有感染特异性，因此可以在山羊痘病毒基因组内插入多种免疫原基因，使其成为活载体疫苗的理想病毒载体。同时，山羊痘致弱疫苗株本身又能诱导较高水平的羊痘免疫保护，因此接种重组山羊痘活载体疫苗可达到一针防多病的目的。

发明内容

本发明提供一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组山羊痘病毒，从而弥补现有技术的不足。

首先，本发明提供一种用于重组山羊痘病毒构建的转移载体(pLSEG-EG95)。所述的转移载体包含有TK基因的左臂(TK_L)和右臂(TK_R)，EG95基因；增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和大肠杆菌gpt两个筛选标记，且该转移载体携带氨苄青霉素抗性基因。

所述的EG95基因开放阅读框(ORF)上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号；

所述eGFP和gpt两个筛选标记分别受p11K和p7.5K启动子转录调控。

作为一种具体的记载，所述的转移载体pLSEG-EG95，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1：

本发明所提供的山羊痘病毒转移载体用于制备表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒，其一种制备方法如下：

制备山羊睾丸上皮细胞，培养至80－90％致密单层，接种山羊痘病毒，37℃进行病毒孵育，按照每孔加150uL无血清OPTI-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I，温柔混匀，再按照每孔加入150uL无血清OPTI-MEM和3μg山羊痘病毒转移载体pLSEG-EG95配制溶液II，然后将溶液II逐滴加入溶液I中，温柔混匀，室温放置20min；在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体-DNA混合液；37℃ 5％CO2培养箱培养6h，吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃ 5％CO2培养箱培养72-96h；转染后24h筛选重组羊痘病毒；

构建得到的重组羊痘病毒用于制备疫苗。