[发明专利]一种表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒在审
| 申请号： | 201810758404.5 | 申请日： | 2018-07-11 |
| 公开（公告）号： | CN108866097A | 公开（公告）日： | 2018-11-23 |
| 发明（设计）人： | 刘拂晓;王志亮;吴晓东 | 申请（专利权）人： | 中国动物卫生与流行病学中心 |
| 主分类号： | C12N15/863 | 分类号： | C12N15/863;C12N15/65 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 266032 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 转移载体 筛选标记基因 转录终止信号 开放阅读框 细粒棘球蚴 亲本病毒 筛选标记 羊痘病毒 重组病毒 启动子 同源臂 蛋白 筛选 上游 基因 引入 污染 | ||
1.一种用于重组山羊痘病毒构建的转移载体，其特征在于，所述的转移载体包含有TK基因的左臂TKL和右臂TKR，EG95基因；增强型绿色荧光蛋白eGFP和大肠杆菌gpt两个筛选标记基因，且该转移载体携带氨苄青霉素抗性基因。
2.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的EG95基因开放阅读框的上游为p7.5K启动子，下游为ATTTTTAT早期转录终止信号。
3.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的eGFP和gpt筛选标记分别受p11K和p7.5K启动子转录调控。
4.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的转移载体的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。
5.权利要求1所述的转移载体在制备表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒中的应用。
6.一种制备表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组羊痘病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
制备山羊睾丸上皮细胞，培养至80－90％致密单层，接种山羊痘病毒，37℃进行病毒孵育，按照每孔加150uL无血清OPTI-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I，温柔混匀，再按照每孔加入150uL无血清OPTI-MEM和3μg权利要求1所述的转移载体配制溶液II，然后将溶液II逐滴加入溶液I中，温柔混匀，室温放置20min；在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体-DNA混合液；37℃5％CO2培养箱培养6h，吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃5％CO2培养箱培养72-96h；转染后24h筛选重组羊痘病毒。
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