[发明专利]靶向鼠源的嵌合抗原受体及其用途

说明书

靶向鼠源的嵌合抗原受体及其用途。本发明公开了一种嵌合抗原受体1D3 scFv‑CD28‑CD3ζ‑GFP及其用途，该嵌合抗原受体由抗鼠CD19单克隆抗体(克隆号：1D3)的轻链和重链可变区(1D3 scFv)、鼠CD28跨膜和胞内区、鼠CD3ζ胞内区以及绿色荧光蛋白(GFP)串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰人或鼠的T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)能用于鼠CD19阳性淋巴瘤、白血病等的治疗，为人CD19 CAR‑T治疗提供了很好的参考价值。体外实验结果表明1D3 CART细胞对肿瘤细胞具有很好的杀伤作用，体内实验结果表明1D3 CART细胞在体内存续时间长。

技术领域

本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向鼠CD19的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。原发性B细胞的急性淋巴白血病小鼠的异种移植模型证明了由CD19介导的CART细胞具有很强的扩增性、持久性和抗肿瘤活性(Milone et al 2009)。最近，通过CLL(Fraietta et al 2016)体内模型和MCL(Ruella etal 2016)的体内模型的临床前研究，证实了CD19介导的CART细胞抗肿瘤活性。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。

本发明所构建的CAR元件scFv片段为鼠来源，克隆号为1D3，1D3杂交瘤来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)其能够产生一种特异性识别鼠CD19的IgG2aκ抗体。本发明构建的1D3-CD28z CART细胞功能学结果证实其具有良好的杀伤肿瘤的特点。

发明内容

本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的信号肽、抗CD19单链抗体、鼠CD28跨膜区、鼠CD28胞内区和鼠CD3ζ胞内区和GFP序列的融合蛋白；和