[发明专利]一种血清中HBV DNA的实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种血清中HBV DNA实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法，所用的裂解液中通过使用多果定代替传统的胍盐和一部分去污剂的使用，有效地对含HBV病毒颗粒的血清样本进行裂解，释放其中的HBV DNA，从而显著的提高了HBV病毒的裂解效率，并大大缩短了检测时间。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种血清中HBV DNA的实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法

背景技术

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒,是一种DNA病毒，根据目前所知，HBV只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，也会被称为丹娜颗粒(Dane)。1965年由丹娜发现，直径为42纳米，颗粒分为外壳和核心两部分。乙型肝炎病毒(HBV)基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。中国的乙肝病毒感染率约60％-70％，乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18％，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。

目前HBV DNA定量的金标准是罗氏公司的Cobas HBV试剂盒，是一种基于Taqman技术的定量PCR方法。这种方法HBV-DNA检测治疗前进行病毒定量检测，可以选择针对性的药品，避免盲目用药，同时也可直接准确地测定体内病毒数量，有助于判断治疗乙肝的效果。

虽然HBV DNA的荧光定量检测方法，已经是一种相对成熟的临床检测方法，但是该方法具有一些缺点，如操作步骤较多，不仅耗时较长，而且易污染，同时会产生较多的废弃物，不利于环境的保护。另外，提取试剂引入的抑制剂，以及洗涤步骤中HBV DNA的损失，都会降低试剂的检出性能。

申请人多年一直致力于HBV检测试剂盒的研究，已有HBV检测类的发明专利201410223058.2，其公开了检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针以及试剂盒和检测方法，该发明可检测出世界范围内各种不同亚型的乙型肝炎病原体，在血清标本中定量检测限可达2IU/mL。但该发明采用的DNA裂解液为常规裂解液，操作相对不够简单，耗时相对较长。

市面上也有如湖南圣湘生物的一步法的HBV荧光定量方法,如中国专利200910309980.2公开了一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法，针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的PCR反应液，实现PCR荧光定量检测，该发明操作简单快速，抗污染抗干扰能力强，提取的核酸无损失，所用试剂制造成本低，但无法对血清中低至20IU/mL的HBV DNA进行准确定量。

多果定(十二烷基胍醋酸盐，Dodine)，是一种含胍基的特殊表面活性剂。主要作为日化用品类表面活性剂，防治果树、蔬菜病害，主要为作用保护，而非无内吸。多果定的防治果树、蔬菜、坚果、观赏植物和成荫树上的多种主要霉菌病害。此外，用于工业水处理剂，洗涤剂，种子处理剂和妇女儿童用品等。

本发明公开了一种实时荧光定量PCR方法，通过使用多果定代替传统的胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)和一部分去污剂(常用的有Tween-20、Triton X-100、SDS等)的使用，有效地对含有HBV病毒颗粒的血清样本进行裂解，释放其中的HBV DNA，并降低对下游实验的抑制，从而显著的提高了HBV病毒的裂解效率，并大大缩短了检测时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清中HBV DNA的实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法。

首先，本发明提供一种血清中HBV DNA的实时荧光定量检测试剂盒，

该试剂盒包括：

乙型肝炎病毒HBV的检测引物组；

乙型肝炎病毒HBV的检测探针；

和裂解液；