[发明专利]农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法

说明书

本发明涉及小麦光腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法。包括：培养TFL冬孢子，当萌发率≥60％时收集菌丝，配制1×10⁶个/ml的菌丝液；将农杆菌接种于LB培养基中，28℃振荡培养2‑3d，用IM培养基稀释至OD₆₀₀为0.5，继续培养7‑8h，用IM培养基稀释至OD₆₀₀为0.45‑0.5；在CM培养基上铺一层无菌玻璃纸，将农杆菌菌液与菌丝液等体积混合并加入AS至200μmol/l，涂布于玻璃纸上，22℃黑暗培养24h；将玻璃纸转移至新的CM培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，16℃培养至菌落长出。该方法能将外源基因成功转入小麦光腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。

技术领域

本发明涉及小麦光腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法。

背景技术

小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetida(Wallr.)Liro,TFL)引起的小麦光腥黑穗病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，在我国北方麦区发生较多，是北京市补充农业植物检疫性有害生物。光腥黑粉菌通过产生有毒的黑色真菌冬孢子释放鱼腥味的三甲胺，引起小麦减产和品质降低，给小麦生产造成毁灭性的危害。此病菌孢子含量超过0.6％即可引起严重中毒现象，人畜食后重者可引起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状(Goats,1999；Hoffman,1982)。因此，对小麦光腥黑穗病的防治刻不容缓。

有关小麦光腥黑粉菌的致病基因及致病分子机理尚不清楚，而构建大容量的小麦光腥黑粉菌转化子库是研究该病菌功能基因及小麦-光腥黑粉菌互作的基础。在众多真菌遗传转化方法中，农杆菌介导的转化技术(ATMT)不仅具有操作简便、转化效率高、受体不受限制等优点，而且转化子稳定性好、T-DNA在真菌基因组中多为单拷贝插入，该技术已在多种真菌的遗传转化中得到广泛应用。然而，由根癌农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌的遗传转化非常困难，目前还未见到根癌农杆菌介导小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系的相关报道。

发明内容

为了促进小麦光腥黑粉菌致病分子机制的研究，本发明提供一种农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，该方法能够将外源基因成功转入小麦光腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。

本发明请求保护的技术方案如下：

农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝液制备：培养小麦光腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×10⁶个/ml的菌丝液；

(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.5，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.45-0.5；

(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD₆₀₀为0.45-0.5的农杆菌菌液与1×10⁶个/ml的菌丝液等体积混合并加入乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/l，然后涂布于玻璃纸上，置于22℃下黑暗培养24h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，16℃培养至菌落长出。

优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。

优选地，培养小麦光腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为(100-105)×10⁴个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于水琼脂培养基上，置于16℃，相对湿度为80％的人工气候生长培养箱中全光照培养。

优选地，所述水琼脂培养基的配方为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L。